18 Ago Cuantificación de Taxol, sus degradantes y sustancias relacionadas mediante UHPLC con detección de aerosol cargado.
Thermo Vanquish Flex Duo: UHPLC-CAD con gradiente inverso
Beneficios de la aplicación
- Respuesta uniforme en elución en gradiente mediante detección de aerosoles cargados (CAD) con el flujo de trabajo de gradiente inverso Thermo Scientific™ Vanquish™ Flex Duo.
- Cuantificación de múltiples especies relacionadas con el API por un solo calibrante.
Objetivo
Demostrar la capacidad de cuantificar múltiples impurezas con un solo calibrador mediante la respuesta uniforme de la detección de aerosoles cargados (CAD), y resaltar las capacidades del sistema HPLC Thermo Scientific™ Vanquish™ Flex Duo para proporcionar compensación de gradiente inverso, esencial para lograr una cuantificación confiable con CAD.
Introducción
El control de impurezas en sustancias farmacéuticas es obligatorio durante el desarrollo de fármacos y a lo largo del ciclo de vida del producto. Las impurezas suelen estar presentes en escasa cantidad respecto al ingrediente farmacéutico activo (API), y no siempre se dispone de estándares de calibración individuales, especialmente en etapas tempranas de desarrollo.
El (U)HPLC con detección UV/Vis es la opción preferida para el análisis, pero presenta limitaciones con sustancias que carecen de cromóforo o que varían considerablemente en sus factores de respuesta. Estos problemas dificultan cumplir los requisitos analíticos de la ICH respecto a los umbrales de notificación, identificación y calificación de impurezas.
La detección de aerosoles cargados (CAD) supera estos desafíos: su respuesta es independiente de la estructura química de los analitos no volátiles, lo que la convierte en un enfoque ideal cuando no se dispone de calibradores individuales. En condiciones isocráticas, la curva de calibración obtenida con un estándar de referencia del API puede usarse para cuantificar todos los analitos no volátiles. Para extender esta respuesta universal a la elución en gradiente, la Bomba Dual Thermo Scientific™ Vanquish™ Flex proporciona un gradiente de compensación post-columna.
En esta nota de aplicación, se utilizó una columna Thermo Scientific™ Accucore™ de pentafluorofenilo (PFP) para separar el fármaco Taxol® (paclitaxel) de sus compuestos relacionados e impurezas, con calibración mediante estándares del fármaco y compuestos relacionados para estimar impurezas desconocidas. Se realizó además un estudio de degradación térmica con análisis por UHPLC-UV-CAD.
Experimental
Consumibles y equipos recomendados
- Columna Accucore PFP 2,6 µm, 2,1 × 150 mm, L43 (N/P 17426-152130)
- Fisher Scientific™ Acetonitrilo de grado LC-MS (P/N A955-212)
- Thermo Scientific™ Sistema de purificación de agua Barnstead™ GenPure™ xCAD Plus (N/P 50136171)
- Thermo Scientific™ Baño seco con agitación y calentamiento digital (N/P 88880028)
Preparación de la muestra — Calibración
El API y las impurezas C y A (cefalomanina) se adquirieron de la Farmacopea Europea y de Estados Unidos, respectivamente. Baccatin III (pureza 97%, Sigma-Aldrich®) se usó solo para identificación de picos. Los estándares se pesaron con precisión, se transfirieron a matraces volumétricos y se enrasaron con metanol hasta 0,1 mg/mL. Se preparó una solución madre de 10 µg/mL con las tres sustancias y se realizaron diluciones a 10, 5, 1 y 0,5 µg/mL, analizadas en tres corridas consecutivas con inyecciones en blanco entre concentraciones. Los estándares se prepararon directamente antes del análisis por su limitada estabilidad en solución.
Degradación forzada
Para el estudio de degradación térmica, se diluyeron 100 µL de solución del fármaco (1 mg/mL) con 350 µL de metanol y 50 µL de DMSO en un tubo Eppendorf de 1,5 mL. La solución se expuso a 65 °C durante 2 horas en baño seco con agitación. La muestra degradada se analizó inmediatamente sin preparación adicional.
Instrumentación
La separación se realizó con una columna Accucore PFP, adecuada para compuestos aromáticos. La detección combinó el detector de longitud de onda variable Vanquish™ Flex y el detector de aerosol cargado Vanquish™ Flex.
El sistema UHPLC Vanquish Flex Duo para gradiente inverso comprendía:
- Base del sistema Vanquish Flex (P/N VF-S01-A-02)
- Bomba doble F (P/N VF-P32-A-01)
- Split Sampler FT (P/N VF-A10-A-02) con loop de muestra de 25 µL
- Compartimento de columna H (P/N VH-C10-A-02)
- Detector de aerosol cargado F (P/N VF-D20-A)
- Detector de longitud de onda variable F (P/N VF-D40-A)
- Vanquish Duo kit de gradiente inverso (P/N 6036.2010)
Esquema fluídico
La Figura 1 ilustra la configuración del flujo de trabajo de gradiente inverso Vanquish Duo. La bomba derecha entrega el eluyente a la columna (gradiente analítico); la bomba izquierda forma el gradiente de compensación directamente en la pieza en T antes del CAD.
Condiciones de separación
Procesamiento de datos
Se utilizó el sistema de datos cromatográficos Thermo Scientific™ Chromeleon™ versión 7.2.8 para adquisición y evaluación de datos.
Resultados y discusión
Calibración global
La respuesta uniforme del CAD se logra de forma rutinaria en condiciones isocráticas. Para compensar el efecto de la composición del disolvente durante un gradiente, se aplica un gradiente inverso post-columna con la Bomba Doble Vanquish Flex. La respuesta UV para 10 µg/mL de tres analitos difería hasta un 63%, mientras que la de CAD difería solo un 2% con gradiente inverso activo. La calibración CAD es lineal para los tres compuestos en el rango de 0,5 a 10 ppm, con una desviación relativa de las pendientes de calibración de solo el 2%.
Análisis de productos de degradación API
Efecto de la compensación de gradiente inverso
La muestra estresada se analizó con y sin compensación de gradiente inverso. Sin compensación, las áreas combinadas de impurezas por CAD representaban el 63,9% del área del API; con compensación, el 53,8%. Esta diferencia de más del 10% se atribuye a la influencia de la composición del solvente en la respuesta de CAD, confirmando la necesidad del gradiente inverso para una cuantificación precisa.
Comparación entre UV y CAD
La combinación de UV y CAD proporciona un perfil más completo de muestras complejas. Algunos picos carecen de actividad UV y no son detectables a 227 nm; uno de los productos de degradación (6,6 min) solo es visible por UV por ser demasiado volátil para CAD. Las dos impurezas principales (24,3 y 27,1 min) son detectables únicamente por CAD. Un producto de degradación de ejemplo (9,8 min), con comportamiento de retención similar al precursor baccatin III, se cuantifica mediante calibración global con una desviación estándar relativa (n=5) del 0,25%.
Conclusión
El flujo de trabajo UHPLC Vanquish Flex Duo con gradiente inverso post-analítico y detección CAD permite una respuesta uniforme durante ejecuciones en gradiente, con variación de pendiente de calibración del 2% para el fármaco y dos impurezas relacionadas. El gradiente inverso corrigió las cantidades medidas de analitos en más del 10%, proporcionando una determinación más precisa de impurezas críticas. Combinado con detección UV, esta configuración de detectores múltiples es una herramienta poderosa para estudios de estabilidad y degradación en laboratorios analíticos farmacéuticos.
Autores: Michael Menz y Frank Steiner, Thermo Fisher Scientific, Germering, Alemania; Ian Acworth, Thermo Fisher Scientific, Chelmsford, MA, EE. UU.
Referencias
- OMS. Cancer fact sheet. www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/en/ (consultado 20/11/2017)
- ICH Guidelines. www.ich.org/products/guidelines (consultado 20/11/2017)
- Paul Gamache. Detección de aerosoles cargados para cromatografía líquida y técnicas de separación relacionadas. Wiley-VCH, mayo de 2017.
- Folleto de detección de aerosoles cargados. tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/D22519.pdf (consultado 20/11/2017)
- Nota técnica Thermo Scientific: Detección de aerosol cargado (CAD): factores que afectan la respuesta uniforme del analito. En prensa.
Solo para uso de investigación. No debe utilizarse en los procedimientos de diagnóstico.
Más información: thermofisher.com/VanquishDuo
Mayor información:
www.sol-analiticas.com
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