GENESYS 50 Thermo Scientific: cloro y hierro en agua potable

Garantizar que el agua potable esté libre de contaminantes no deseados es de suma importancia. Estos contaminantes no solo pueden alterar el sabor y la apariencia del agua, sino que también pueden generar problemas de salud pública. Por ello, la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (EPA) ha establecido requisitos para los niveles seguros de contaminantes comunes en fuentes de agua potable.

Estos contaminantes pueden abarcar desde materiales inorgánicos, como plomo o hierro, hasta compuestos orgánicos (p. ej., tetracloruro de carbono, glifosato) e incluyen una gran cantidad de sustancias que requieren identificación. Entre las técnicas analíticas disponibles para este análisis, una de las más empleadas es la espectroscopía de absorción UV-Visible.

Este método se basa en la capacidad de la luz UV-Visible para inducir transiciones entre el estado electrónico fundamental y el estado excitado dentro de un compuesto. Debido a que estas transiciones son específicas del compuesto analizado, el método puede proporcionar información cualitativa y cuantitativa única sobre la sustancia medida. Al estar basado estrictamente en interacciones de la luz con la muestra, ofrece un análisis rápido y no destructivo.

En muestras de agua, un número significativo de procedimientos involucra el uso de indicadores colorimétricos para analitos que no absorben fácilmente en la región UV-Visible. En estos métodos, la interacción entre el analito y el reactivo colorimétrico produce un cambio de color en la solución, observable mediante espectroscopía de absorción UV-Visible. Según la ley de Beer:

donde A_λ es la absorbancia medida, l es la longitud del trayecto de la cubeta, ε_λ es el coeficiente de extinción y c es la concentración del analito. La concentración es linealmente proporcional a la absorbancia, por lo que los análisis de absorción permiten cuantificar el contenido de analitos en una muestra.

En este documento se utilizaron dos análisis colorimétricos para determinar el contenido total de cloro y hierro en muestras de agua de grifo, empleando el espectrofotómetro UV-Visible Thermo Scientific GENESYS 50. Los análisis se llevaron a cabo con métodos preconfigurados incluidos en el software GENESYS Water Analysis. Además, se utilizaron soluciones estándar para verificar la precisión de los métodos preconfigurados para cloro total y hierro total.

Kits de análisis de agua

Para el análisis de cloro total y hierro total (Fe²⁺ y Fe³⁺), se emplearon los kits Thermo Scientific Orion AC4P72 para cloro total y Thermo Scientific Orion AC4P78 para hierro (II y III). Ambos kits se utilizaron tal como se recibieron.

El kit de cloro total se basa en la reacción colorimétrica entre el cloro y el sulfato de N,N’-dietil-p-fenilendiamina (DPD), que produce un cambio de color de incoloro a rosa. El kit de hierro utiliza la reacción entre la 1,10-fenantrolina y los iones Fe²⁺, que cambia el color de la solución de incoloro a rojo/naranja. Este kit incluye además un agente reductor que convierte el Fe³⁺ residual en Fe²⁺, permitiendo determinar el contenido total de hierro.

Preparación de muestras: estándares de hierro

Para la prueba de análisis de hierro total, se prepararon soluciones estándar de Fe²⁺ para confirmar la precisión del método. Se preparó una solución madre disolviendo 32,6 mg de sulfato de amonio y hierro(II) en 47,0 mL de agua desionizada (DI), que luego se diluyó para obtener una solución de 10 mg/L de Fe²⁺.

También se prepararon estándares de Fe³⁺ para confirmar que el kit evalúa con precisión el contenido de hierro en ambos estados de oxidación. La solución madre de Fe³⁺ se obtuvo disolviendo 42,7 mg de cloruro férrico en 10,0 mL de agua DI, diluyéndose posteriormente para generar una solución de 30 mg/L de Fe³⁺.

Se prepararon soluciones estándar de concentraciones conocidas de Fe²⁺ y Fe³⁺ diluyendo las respectivas soluciones madre con agua DI. Para ambos estados de oxidación se generaron tres soluciones estándar (0,35 mg/L, 0,75 mg/L y 1,50 mg/L). A cada solución se le agregó un paquete de polvo reactivo de hierro del kit AC4P78, que se dejó disolver completamente antes del análisis UV-Visible. Estas muestras se prepararon por triplicado.

Para el análisis de curva estándar realizado sin el método preconfigurado, se generaron tres soluciones separadas:

1. Solución madre de 1,10-fenantrolina (18 mM): se disolvieron 32,5 mg de 1,10-fenantrolina en 10 mL de agua DI.
2. Solución madre de acetato de sodio (1,0 M): se disolvieron 820,6 mg de acetato de sodio en 10 mL de agua DI.
3. Solución madre de hidrocloruro de hidroxilamina (0,30 M): se disolvieron 205,8 mg de hidrocloruro de hidroxilamina en 10 mL de agua DI.

Las soluciones estándar y las muestras se prepararon según lo descrito en la Tabla 1.

Preparación de estándares de Fe²⁺ y muestras para el análisis de curva estándar.

Preparación de muestras: estándares de cloro

Se generaron soluciones estándar de cloro para confirmar la validez del método preconfigurado de cloro total. El reactivo DPD también reacciona con KMnO₄, produciendo un cambio de color similar al observado con cloro. Según el procedimiento del kit AC4P72, la respuesta de una solución de 0,891 mg/L de KMnO₄ es equivalente a la de una solución de cloro de 1,00 mg/L. Por lo tanto, se utilizó KMnO₄ como estándar secundario para confirmar la precisión del método.

Se preparó una solución madre de KMnO₄ de 1890 mg/L disolviendo 18,9 mg de KMnO₄ en 10 mL de agua DI, que se diluyó para obtener una solución de 10 mg/L. Luego se prepararon cuatro soluciones de KMnO₄ (0,089 mg/L, 0,22 mg/L, 0,67 mg/L y 1,34 mg/L) diluyendo la solución madre.

La Tabla 2 detalla la correspondencia entre concentración de KMnO₄ y concentración de cloro percibida según el método DPD. A 10 mL de cada muestra se añadió un paquete del reactivo en polvo del kit AC4P72 y se dejó disolver completamente. Este procedimiento se repitió para generar tres muestras independientes, que luego se analizaron por espectroscopía UV-Visible.

Para determinar el límite de detección (LOD) y el límite de cuantificación (LOQ) del análisis preconfigurado de cloro total, se prepararon siete muestras en blanco disolviendo un paquete del reactivo del kit en 10 mL de agua DI para cada réplica.

Concentraciones de KMnO₄ y concentraciones correlacionadas de cloro.

Preparación de muestras: agua de grifo

Para demostrar el análisis de agua potable, se recolectaron muestras de agua de grifo de dos fuentes diferentes, utilizadas para los análisis de cloro y hierro mediante los métodos preconfigurados. Como en los estándares anteriores, se añadió un paquete de reactivo en polvo —para cloro o para hierro— a 10 mL de cada muestra. Las soluciones se prepararon y midieron por triplicado.

Instrumentación

Todas las muestras se midieron con el espectrofotómetro UV-Visible Thermo Scientific GENESYS 50. El software GENESYS Water Analysis se empleó para medir el contenido total de cloro y hierro mediante métodos preconfigurados diseñados para el kit de cloro total (AC4P72) y el kit de hierro II y III (AC4P78). El instrumento estaba equipado con un soporte de tubos y se utilizó un vial de 24 mm de diámetro.

En ambos métodos preconfigurados se monitoreó la absorbancia a 510 nm, y se utilizó la ecuación de curva estándar incorporada para convertir la absorbancia en concentración. El fondo de la medición se estableció disolviendo el contenido de un paquete de reactivo en 10 mL de agua DI. Todas las muestras y estándares se midieron por triplicado.

Para el método de curva estándar de hierro, se utilizó la aplicación Quant del software local del GENESYS 50. La absorbancia de los estándares de la Tabla 1 se midió a 510 nm para desarrollar la curva estándar, y las muestras se midieron también a 510 nm en cubeta de cuarzo de 10 mm, usando agua DI como blanco.

Las mediciones de escaneo se realizaron con la aplicación Scan del GENESYS 50. Los espectros de absorción se midieron entre 325 y 1100 nm con velocidad de escaneo lenta y paso de 1,0 nm. Las muestras se colocaron en un vial de 24 mm de diámetro, usando agua DI como blanco.

Resultados y discusión

Análisis de hierro

La presencia de hierro en el agua potable puede alterar su sabor y causar decoloración. Aunque no representa un riesgo significativo para la salud, la EPA ha establecido estándares secundarios para el agua potable que incluyen el hierro, relevantes por razones estéticas.

Existen varios métodos para la cuantificación de hierro en agua, entre ellos la reacción entre la 1,10-fenantrolina y los iones Fe²⁺ como indicador colorimétrico. En este método, la muestra incolora se torna naranja en presencia de Fe²⁺ por la formación de ferroína, un complejo de coordinación compuesto por tres moléculas de 1,10-fenantrolina y un ion Fe²⁺ (Figura 1a). Se utiliza frecuentemente un agente reductor como la hidroxilamina para asegurar la conversión de Fe³⁺ en Fe²⁺ antes del análisis. El hidrocloruro de hidroxilamina también se emplea para convertir los iones residuales de Fe³⁺ en Fe²⁺, permitiendo la detección de ambos estados de oxidación.

La Figura 1b muestra los espectros de absorción UV-Visible de los reactivos del kit AC4P78 con y sin sulfato de amonio y hierro(II). Sin Fe²⁺, el espectro presenta un inicio de absorción alrededor de ~400 nm con una cola hasta ~550 nm. Con Fe²⁺, el complejo de ferroína genera una característica de absorción con máximos en ~480 nm y ~510 nm. En los experimentos de este documento, la absorbancia medida a 510 nm se utilizó para determinar el contenido de hierro.

(a) Estructura del complejo entre Fe²⁺ y 1,10-fenantrolina. (b) Espectros UV-Visible de los reactivos de hierro en agua DI (línea negra) y una solución de Fe²⁺ de 1,0 mg/L (línea roja). Espectros recolectados en vial de 24 mm de diámetro.

Tradicionalmente, se preparan muestras con diferentes concentraciones de hierro y se mezclan con el reactivo colorimétrico para construir una curva de calibración. Se mide la absorbancia a 510 nm y se grafica en función de la concentración. La ley de Beer indica que esta relación es lineal, por lo que la curva estándar se ajusta a una función lineal para calcular la concentración del analito en muestras desconocidas.

El software GENESYS Water Analysis incluye las funciones lineales necesarias para los métodos que requieren curva estándar. Aunque construir una curva estándar al inicio es una buena práctica, las curvas preconfiguradas reducen el tiempo de análisis.

Para evaluar la precisión del método preconfigurado de análisis de hierro, se analizaron tres estándares de Fe²⁺ (0,35, 0,75 y 1,5 mg/L) con el método “AC4P78, Iron, II & III” del software GENESYS Water Analysis. La Tabla 3 muestra la absorbancia medida y las concentraciones calculadas. El porcentaje de diferencia respecto a la concentración esperada se calculó usando la Ecuación 2:

donde C_t es la concentración verdadera y C_o es la concentración observada. Los resultados indican que el método preconfigurado produjo concentraciones calculadas con una diferencia porcentual inferior al 5%.

Como referencia, se construyó una curva estándar usando estándares preparados sin los reactivos del kit (ver sección Experimental). Las muestras con las mismas concentraciones de Fe²⁺ se analizaron con esta curva construida manualmente (Figura 2) y los valores se reportaron en la Tabla 3. Esta curva no utiliza los reactivos colorimétricos del kit AC4P78, pero sí la misma reacción colorimétrica entre Fe²⁺ y 1,10-fenantrolina.

Curva estándar construida manualmente para el análisis de hierro en presencia de 1,10-fenantrolina.

Absorbancia, concentración calculada de Fe y diferencias porcentuales para soluciones estándar de Fe²⁺, con el método GENESYS Water Analysis y el método de curva estándar.

Como se muestra en la Tabla 3, el método de curva estándar también determinó con precisión la concentración de Fe²⁺ en cada muestra, con diferencias porcentuales por debajo del 5%. Las diferencias en absorbancia entre métodos se explican por el uso de contenedores de distinto tamaño: el kit requiere un vial de 24 mm y la curva estándar se construyó con cubeta de cuarzo de 10 mm; según la ley de Beer, se espera una absorbancia más baja para este último. Los resultados indican que el método preconfigurado es preciso dentro del rango de concentración descrito y puede utilizarse en lugar de una curva estándar construida manualmente.

En el método de 1,10-fenantrolina se requiere un agente reductor para convertir Fe³⁺ en Fe²⁺, ya que el primer ion no puede formar ferroína. Para verificar que los reactivos del kit AC4P78 reducen adecuadamente el Fe³⁺, se analizaron tres muestras con concentraciones conocidas de Fe³⁺ (0,35, 0,75 y 1,5 mg/L) según las instrucciones del kit. La Tabla 4 incluye la absorbancia medida y la concentración calculada. Al igual que con Fe²⁺, la diferencia porcentual es <5%, lo que confirma que el método preconfigurado funciona correctamente para muestras de Fe³⁺ dentro del rango especificado.

Absorbancia, concentraciones calculadas de Fe y diferencias porcentuales para soluciones estándar de Fe³⁺ con el software GENESYS Water Analysis y el método de curva estándar.

Para muestras más realistas, se analizaron dos muestras de agua potable con el método preconfigurado y el método de curva estándar. La absorbancia medida a 510 nm para ambas muestras (Tabla 5) estuvo por debajo del nivel de ruido del GENESYS 50 y, por lo tanto, por debajo del límite de detección. Si el hierro está presente, se encuentra en concentraciones no detectables por estas técnicas UV-Visibles. Según los estándares secundarios de la EPA, el contenido de hierro aceptable debe ser <0,3 mg/L; ambas muestras cumplen con este requisito.

Absorbancia medida y concentración de hierro calculada para muestras de agua de grifo.

Análisis de cloro

Otros contaminantes pueden representar un riesgo para la salud pública. El crecimiento de bacterias en agua potable se previene mediante desinfectantes como cloro y/o cloramina. Sin embargo, el exceso de estos desinfectantes también puede ser perjudicial, por lo que es importante conocer la concentración de cloro para asegurar que no supere los niveles seguros.

Un método ampliamente utilizado para determinar el contenido de cloro emplea la espectroscopía UV-Visible. El kit Orion AC4P72 utiliza la reacción entre el sulfato de N,N-dietil-p-fenilendiamina (DPD) y el cloro libre, produciendo un cambio de color de incoloro a rosa con máximos de absorción a 475 nm, 511 nm y 553 nm (Figura 3). Para muestras que contienen cloramina, se usa yoduro de potasio, que produce un compuesto que reacciona adicionalmente con el DPD residual. Monitoreando la absorbancia a 510 nm en función de la concentración de cloro, se puede cuantificar el contenido de cloro libre. El software GENESYS Water Analysis incluye el método preconfigurado de análisis colorimétrico DPD para cloro libre (kit AC4P72).

Espectros de absorción UV-Visible de reactivos para análisis de cloro en agua (negro), 0,89 mg/L de KMnO₄ (morado) y 0,89 mg/L de KMnO₄ con reactivos de análisis de cloro (rojo). Muestras en frasco de 24 mm de diámetro.

Para evaluar la precisión del método preconfigurado de cloro libre, se prepararon y analizaron cuatro estándares con el método “AC4P72”. Dado que las soluciones de cloro son inestables y pueden degradarse con el tiempo, se usó KMnO₄ como estándar secundario. Se utilizó un conjunto de estándares de KMnO₄ (0,089, 0,22, 0,67 y 1,34 mg/L) para verificar la precisión del software GENESYS Water Analysis.

Concentración calculada de Cl₂ de soluciones estándar y diferencia porcentual.

La Tabla 6 incluye la concentración de cloro calculada para cada muestra de KMnO₄, así como la concentración esperada. La diferencia porcentual para cada muestra, con excepción de la de menor concentración, está por debajo del 5%. La diferencia del 20% para la muestra de 0,089 mg/L de KMnO₄ sugiere que esta muestra pudo no haber sido preparada correctamente, o que esta concentración podría estar por debajo del LOQ y/o LOD.

El LOD define la menor cantidad medible que puede distinguirse del blanco. El blanco es la muestra sin analito pero con los reactivos colorimétricos. El LOD puede calcularse usando la desviación estándar de la absorbancia medida para soluciones en blanco replicadas y el promedio de esas mediciones, según la Ecuación 3:

donde x_b es la absorbancia promedio de las muestras en blanco y s_b es su desviación estándar.

Si los datos se ajustan a una función lineal, el LOD también puede calcularse usando la pendiente de la línea y el error estándar de la estimación, como muestra la Ecuación 4:

donde s_y es el error estándar de la estimación y m es la pendiente de la curva lineal. Como los métodos preconfigurados no proporcionan estos datos, se utilizó la Ecuación 3.

Para el análisis de cloro total, se midieron siete soluciones en blanco con el método preconfigurado. El LOD resultante fue 0,018 A, correspondiente a una concentración de 0,014 mg/L. El LOQ, calculado según la Ecuación 5, fue 0,041 A, correspondiente a una concentración de 0,053 mg/L:

Para la muestra de concentración más baja (0,089 mg/L de KMnO₄, equivalente a 0,1 mg/L de cloro), la absorbancia medida está por encima del LOD y el LOQ calculados, lo que sugiere que pudo haber sido preparada incorrectamente.

Concentración calculada de Cl₂ en muestras de agua de grifo.

De manera similar al análisis de hierro, se probaron dos muestras de agua de grifo para determinar el contenido de cloro total (Tabla 7). La muestra 1 dio una absorbancia de 0,012 ± 0,003 A, por debajo del LOD de 0,018 A, por lo que no fue posible detectar el cloro; su contenido está por debajo del límite aceptable de 4,0 mg/L. La muestra 2 presentó una absorbancia de 0,025 ± 0,003 A, por encima del LOD pero por debajo del LOQ, por lo que la concentración de cloro total debe reportarse como <0,053 mg/L. Ambas muestras están por debajo de los límites aceptables establecidos por la EPA.

Conclusiones

Los experimentos detallados en este estudio destacan la precisión de las técnicas de absorción UV-Visible para el análisis de hierro y cloro en muestras de agua, incluso a bajas concentraciones de analito. Los resultados confirman la fiabilidad de los métodos preconfigurados de análisis de agua GENESYS para la determinación cuantitativa de estas sustancias en agua potable. El análisis de dos muestras de agua demostró niveles por debajo de los designados por la EPA para cloro y hierro, lo que ilustra la utilidad de esta técnica rápida y no destructiva para el análisis de agua potable.

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