04 May Agua Ultrapura como componente para ensayos multiparamétricos usados en descubrimiento de fármacos
Sartorius arium pro VF: agua ultrapura en ensayos NGS y PCR
El agua ultrapura se utiliza para diversas aplicaciones de biotecnología como el cultivo de células, procedimientos bioquímicos y técnicas de biología molecular, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Este artículo describe el uso específico del agua ultrapura generada por el sistema de agua de laboratorio arium® pro VF de Sartorius como componente esencial en ensayos multiparamétricos basados en células.
Dichos ensayos, llamados ensayos EXT, se emplean en las primeras etapas del descubrimiento de fármacos. En estos ensayos, las actividades de señalización celular son capturadas por reporteros de códigos de barras moleculares, dando como resultado grandes conjuntos de datos obtenidos mediante secuenciación de nueva generación (NGS). En una muestra experimental, se trataron propiedades de señalización diferenciales causadas por un estímulo específico (dominio de tipo EGF) o por un estímulo amplio (PMA y suero). Las células estimuladas con dominio de tipo EGF mostraron una respuesta del gen temprano inmediato, mientras que la adición de PMA y suero causó la activación de vías de respuesta inmunitaria. La adición de lapatinib inhibió prácticamente todas las respuestas inducidas por el dominio de tipo EGF, mientras que las respuestas de PMA/suero se revirtieron solo parcialmente. El agua ultrapura fue utilizada con efectividad en varios pasos del proceso, incluyendo el aislamiento de reporteros de códigos de barras moleculares, su amplificación mediante distintas estrategias PCR y las ejecuciones de NGS.
1. Introducción
En la investigación biomédica y el descubrimiento de fármacos, los ensayos basados en células se combinan cada vez más con técnicas multiparamétricas para investigar procesos de enfermedad complejos y los efectos de los compuestos de manera más eficaz. Estos ensayos requieren métodos de biología molecular y celular que utilizan agua ultrapura como base para técnicas como la PCR o el cultivo de células.
Los ensayos basados en células se aplican para identificar diferencias en las acciones de señalización celular causadas, por ejemplo, por la adición de un compuesto dado. Estas diferencias pueden estar determinadas por cambios relativos de clases definidas de moléculas informativas (ARN mensajero, ARN micro, proteínas, etc.). Investigar los efectos de moléculas biológicamente relevantes en actividades celulares definidas es un proceso que demanda tiempo, recursos y consumibles considerables, además de exigir la máxima pureza de las soluciones empleadas, como el agua. Por estas razones, los ensayos multiparamétricos son cada vez más importantes.
Descripción del procedimiento del ensayo
Los ensayos multiparamétricos basados en células permiten el análisis de la acción de compuestos sobre muchas moléculas celulares objetivo (targets) y la creación paralela de perfiles de vías de señalización celular. Estos análisis exhaustivos son necesarios para demostrar el efecto terapéutico deseado e identificar posibles efectos secundarios. También pueden utilizarse para el descubrimiento de nuevos usos de fármacos aprobados (estudios de reposicionamiento de medicamentos). La adquisición de grandes conjuntos de datos a partir de ensayos multiparamétricos aporta beneficios de costo significativos, por ejemplo mediante la tecnología de ensayos EXT [1].
Esta tecnología se basa en reporteros de códigos de barras moleculares que permiten ensayos altamente paralelos. EXT significa Expressed Sequence Tag (marcador de secuencia expresada): los EXTs son pequeñas moléculas sintéticas de ARN con una secuencia codificada específicamente de 49 bp. La tecnología de ensayos EXT permite la adquisición de varios millones de conjuntos de datos en una sola medición, de modo que las actividades de señalización celular individuales capturadas por reporteros codificados molecularmente pueden analizarse por secuenciación [1] (Fig. 1a). Los ensayos de gen reportero estándar permiten mediciones de solo uno o dos puntos de datos por unidad; por el contrario, los ensayos EXT utilizan reporteros moleculares conectados constantemente a una actividad de señalización individual, con una etiqueta molecular que permite el análisis preciso de las expresiones espaciales y temporales del reportero (Fig. 1b).
En los ensayos multiparamétricos descritos en este documento, la NGS se usa como sistema de lectura para el análisis funcional y cuantitativo de varias actividades celulares.
Figura 1: A) Los ensayos EXT permiten el análisis simultáneo de diferentes actividades de señalización celular en una medición, proporcionando más de 10 millones de conjuntos de datos por experimento. B) Los ensayos muestran especificidades y perfiles de actividades de señalización celular de sustancias bajo distintas condiciones, capturadas simultáneamente en una medición.
2. Materiales y métodos
Usos del agua ultrapura en ensayos multiparamétricos
El agua ultrapura cumple un papel crítico en varios pasos de los experimentos con reporteros EXT. En este estudio se utilizó agua ultrapura en autoclave para humidificar incubadoras de cultivo celular y asegurar una incubación libre de esporas y microbios. También se empleó para determinar parámetros de biología molecular (concentraciones de ADN y ARN), para preparar muestras de NGS (purificación de reporteros EXT mediante kit de aislamiento de ARN, transcripción inversa en secuencias de ADNc y pasos de PCR para amplificar el material reportero para secuenciación de alto rendimiento), y en las ejecuciones de NGS realizadas con la Ion Torrent Personal Genome Machine® (secuenciador Ion PGM™) de Life Technologies.
El agua ultrapura fue producida usando el sistema arium® pro VF (Fig. 2) según se describe en Nitzki y Herbig [3].
Cultivo celular
Células PC12-tet-OFF (PC12-OFF) (Clontech) fueron cultivadas en medio DMEM (concentración de glucosa de 1 g/l, de Lonza) en placas revestidas de poly-L-lisina a 37°C en una incubadora con atmósfera de aire humidificada por agua ultrapura que contiene 5% de CO2. El medio fue suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 5% de suero de caballo (HS), 1% de penicilina estreptomicina y 1% de GlutaMAX (Invitrogen).
Transfección de ensayo de vectores reporteros
Se transfectaron células PC12-OFF en suspensión con vectores reporteros de ensayo. Las células fueron tripsinizadas, sedimentadas y resuspendidas en DMEM (suplementado con 1% de FBS) con una densidad de 10⁶ células por ml. Los complejos de ADN-lipofectamina se prepararon con 1 µg de ADN y 4 µl de lipofectamina 2000 (Invitrogen) en alícuotas de 100 µl de medio OptiMEM por 1,5 × 10⁶ células. Después de 20 minutos de incubación a temperatura ambiente, la mezcla se combinó con la suspensión celular y se incubó a 37°C durante 4 horas. Las células se lavaron una vez con medio DMEM (1% de FCS) para eliminar los reactivos de transfección. Se usaron 5 ng por ADN plásmido y por constructo exportador EXT. De tres a cinco constructos reporteros se clonaron con diferentes EXTs por cada elemento regulador en cis.
Purificación de muestras de secuenciación
Extracción de ARN
El ARN se purificó usando el kit Qiagen RNeasy con digestión de DNasa-I en columna según el protocolo del fabricante. Tras la purificación, las muestras se precipitaron en la mitad del volumen de acetato de amonio 7,5 M (preparado con agua ultrapura) y tres veces el volumen de etanol 100%. Para la síntesis de ADNc se usaron 1 µg de ARN extraído, transcriptasa inversa Superscript III (Invitrogen) y unos 120 pmol de cebadores aleatorios nanomer. Las muestras fueron evaluadas para determinar la pureza del ARN y se excluyó la posible contaminación de ADN ejecutando controles sin transcriptasa inversa (−RT).
Amplificación de productos EXT-ADNc por PCR para decodificación
Las ejecuciones de decodificación de PCR se realizaron con ADN polimerasa HotStarTaq Plus y dNTPs (Qiagen) y agua ultrapura. Se ejecutaron treinta ciclos de 3 pasos (30 s a 95°C, 30 s a 59°C y 30 s a 72°C) (Fig. 3). El ADNc transcrito en forma inversa sirvió como material de partida. No se utilizó ADNc en el control negativo (último rastro).
Las ejecuciones de codificación de PCR se llevaron a cabo con ADN polimerasa HotStarTaq Plus y agua ultrapura; se ejecutaron diez ciclos de 3 pasos (30 s a 95°C; 20 s a 58°C; 20 s a 72°C) (Fig. 3). Para cada codificación de PCR se utilizó 1 µl de una muestra de decodificación de PCR diluida 1:10 como material de partida; no se utilizó ADNc en el control negativo. Todos los productos de PCR se visualizaron y verificaron mediante electroforesis en gel de agarosa.
Figura 3: Control de calidad de etapas de PCR por amplificadores de EXT. Ejecución de gel de agarosa de A) Decodificación de PCR y B) Codificación de PCR. El último rastro indica el control negativo con agua ultrapura.
Secuenciación por método semiconductor
Las moléculas informativas EXT fueron secuenciadas por NGS usando una Ion PGM™ machine (Fig. 4). La tecnología de secuenciación está basada en la detección secuencial de protones liberados durante el proceso de polimerización de ADN. Según la base a polimerizar (adenina, guanina, citosina o timina) en la cadena complementaria, se incorpora el correspondiente dNTP y se libera un protón detectado por sensores de iones [4].
Figura 4: Ion Torrent Personal Genome Machine® (secuenciador Ion PGM™) (fuente: laboratorio de Systasy Bioscience GmbH, Múnich, Alemania).
Análisis de la secuencia
Se utilizaron herramientas individuales basadas en UNIX del kit de herramientas FastX [5] para analizar los datos de secuenciación (programa de conversión FASTQ-to-FASTA y separador de códigos de barras FASTX). La presencia e identificación de cada EXT se determinó mediante análisis BLAST [6] en una biblioteca de referencia de EXTs propia. Los EXTs expresados diferencialmente fueron identificados y cuantificados utilizando scripts R [7].
3. Resultados
La plataforma de ensayos multiparamétricos se utilizó en combinación con la NGS y el agua ultrapura para medir un amplio número de respuestas de señalización celular aguas abajo: a) estímulo específico, b) estímulo amplio, c) adición de un inhibidor específico. Las células PC12 se transfirieron con 33 reporteros EXT diferentes, representando actividades de once vías de señalización celular. Para el estímulo específico (a), se transfectó el receptor ERBB4, que tiene un rol en el desarrollo del corazón, la diferenciación de neuronas y enfermedades humanas como cáncer o trastornos psiquiátricos, incluyendo esquizofrenia [8, 9]. El receptor ERBB4 puede activarse mediante el dominio soluble de neurregulina 1 (dominio de tipo EGF, EGFld). La actividad de señalización ERBB4 mediada por EGFld fue bloqueada por el inhibidor de quinasa lapatinib (c). Como estímulo amplio (b) se seleccionó forbol-12-miristato-13-acetato (PMA).
Agua ultrapura como componente integral de la preparación de muestras para secuenciación
El agua ultrapura se usó con éxito en múltiples pasos de la preparación de muestras (Fig. 5), incluyendo ejecuciones de PCR (decodificación y codificación, Fig. 3) y reacciones de secuenciación con el secuenciador Ion PGM™ (Fig. 6). Este instrumento requiere agua con conductividad de 18,2 MΩ·cm según su manual de instrucciones [11]; de lo contrario, una secuenciación fiable no estaría garantizada.
El agua ultrapura utilizada en este estudio estaba libre de cantidades detectables de RNasa y DNasa (concentraciones por debajo de los límites de detección de 20 ng/ml y 80 ng/ml, respectivamente) y se entregó con la calidad constante requerida: concentración de TOC ≤ 2 ppb y conductividad de 18,2 MΩ·cm compensada a 25°C.
Figura 5: Flujo de trabajo para purificación de muestras de secuenciación y uso de agua ultrapura en las diferentes etapas.
Figura 6: Control de calidad de secuenciación con la Ion Torrent PGM®. A) Densidad de partículas ISP. B) Resumen ISP: densidad de carga (87%, 9,84 millones de pocillos), enriquecimiento (95%), ISPs clonadas (97%), total de reads (7,26 millones) y reads utilizables para análisis (6 millones). C) Duración media de las secuencias obtenidas individualmente.
Análisis cuantitativo y cinético de actividades de señalización celular
El análisis cuantitativo y cinético de actividades de señalización aguas abajo muestra un patrón de activación diferencial específico para cada estímulo (Fig. 7). En las células tratadas con EGFld, la respuesta de los genes tempranos inmediatos (IEG) se activó considerablemente (los IEGs son genes activados transitoria y rápidamente en respuesta a estímulos celulares a través de las cascadas de señalización MAP quinasa; ejemplares IEGs: EGR1, EGR2, FOS, FOSB y JUN [12]), mientras las vías de señalización relacionadas con respuestas al estrés inmunológico (IL6, IL8 y NFkB) no se activaron (Fig. 7, columnas 1–4). Las células tratadas con EGFId más lapatinib mostraron una inactivación casi completa de todas las vías de señalización medidas (Fig. 7, columnas 5–8). En las células estimuladas con PMA/suero, las respuestas al estrés inmunológico se indujeron notablemente (Fig. 7, columnas 9–12), y solo fueron revertidas parcialmente tras el tratamiento con lapatinib (Fig. 7, columnas 13–16).
Figura 7: Análisis cuantitativo y cinético de actividades de señalización celular usando tecnología de ensayos EXT. Actividades inducidas por EGFld o PMA/suero, inhibidas en distintos grados por lapatinib. Los números de columna se indican en cursiva.
El agua ultrapura se usó eficazmente en los ensayos multiparamétricos y los análisis NGS posteriores. Este método de perfilado puede disminuir el riesgo de fracaso y los costos en el descubrimiento de fármacos.
4. Conclusión
El agua ultrapura empleada en este estudio puede utilizarse sin problemas para aplicaciones bioquímicas, de biología molecular y biología celular, proporcionando resultados significativos. Fue utilizada en los pasos críticos de la preparación de muestras de NGS mediante estrategias PCR y en las ejecuciones de secuenciación de alto rendimiento (Figs. 3 y 6). Los ensayos multiparamétricos permitieron identificar respuestas de señalización celular diferenciadas entre un estímulo amplio y uno específico (Fig. 7).
Las reacciones de secuenciación requieren altos estándares de calidad del agua que el sistema arium® pro VF cumple gracias a su concentración de TOC excepcionalmente baja y su calidad constante. Además, el agua ultrapura obtenida estaba libre de actividad nucleasa detectable, característica fundamental ya que cualquier rastro de actividad nucleasa podría interferir con aplicaciones sensibles de biología molecular como las ejecuciones de PCR. La conductividad constante de 18,2 MΩ·cm permite una secuenciación precisa con la Ion PGM™.
El agua purificada con parámetros de calidad insuficientes o con ligeras impurezas dará lugar a resultados no reproducibles. El agua de red debe evitarse por completo, ya que contiene sales, componentes orgánicos, nucleasas, microorganismos y moléculas de ADN libres, con calidad variable según la región.
Resumen
Los ensayos multiparamétricos permiten un perfilado integral de actividades de señalización celular y son cada vez más usados en fases tempranas del descubrimiento de fármacos. Los ensayos descritos están basados en sensores genéticos acoplados a reporteros de códigos de barras moleculares y requieren que todos los materiales utilizados cumplan los más altos estándares de calidad. Esto fue demostrado para el agua ultrapura generada por el sistema arium® pro VF, utilizada con éxito en diversas etapas experimentales de los ensayos multiparamétricos.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a Ben Brankatschk, Sabrina Galinski, Alexandra Rupp y Elena Ciirdaeva por su apoyo, contribuciones y debates.
Literatura
[1] Botvinnik et al. Integrated analysis of receptor activation and downstream signaling with EXTassays. Nat. Methods. 2010 Jan; 7(1): 74–80.
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[6] Altschul S.F. et al. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 1990 Oct 5; 215(3): 403–410.
[7] R Core Team. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. 2012.
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[10] Wehr M. C. et al. Monitoring regulated protein-protein interactions using split TEV. Nat. Methods. 2006 Dec; 3(12): 985–993.
[11] Life Technologies. Ion PGM™ Sequencing 200 Kit v2. 2013. Disponible en: https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4482006.
[12] Avraham R., Yarden Y. Feedback regulation of EGFR signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 2011 Feb; 12(2): 104–117.
Sven P. Wichert (1), Elmar Herbig (2), Michael C. Wehr (1)
Correspondencia: Michael C. Wehr, Systasy Bioscience GmbH, Adams-Lehmann-Str. 56, 80797 Múnich, Alemania; email: wehr@systasy.de
(1) Instituto Max Planck para medicina experimental, Goettingen, Alemania; ahora Systasy Bioscience GmbH, Múnich, Alemania.
(2) Sartorius Lab Instruments GmbH & Co. KG, Goettingen, Alemania.
Mayor información:
Sartorius Argentina S.A.
Tel.: +54 11 4721-0505
leadsarg@sartorius.com
www.sartorius.com
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