13 Abr Análisis de Cromatografía Líquida simultánea HPLC y UHPLC de impurezas de acetaminofeno utilizando un solo instrumento
Análisis HPLC/UHPLC Simultáneo: Acetaminofeno con Vanquish Duo
Autores: Maria Grübner, Carsten Paul, Frank Steiner (Thermo Fisher Scientific, Germering, Germany)
Fuente: Nota de Aplicación Técnica Thermo Fisher Scientific
Objetivo
Demostrar las capacidades del sistema Thermo Scientific™ Vanquish™ Flex Duo UHPLC para Dual LC para funcionar métodos HPLC independientes y UHPLC simultáneamente utilizando un solo instrumento.
Beneficios de la Aplicación
- La tecnología LC dual proporciona dos canales LC independientes ocupando el espacio de un solo instrumento.
- Los métodos de HPLC establecidos y sus contrapartes UHPLC pueden implementarse en paralelo en el mismo instrumento.
Introducción
En los laboratorios analíticos actuales, un gran número de métodos analíticos generalmente se establecen y utilizan para el análisis de cientos de muestras. Para aumentar el rendimiento y generar más resultados, existe una creciente necesidad de métodos más rápidos e instrumentación analítica adicional. Por lo tanto, los instrumentos compatibles con UHPLC y las restricciones de espacio juegan un papel cada vez más importante en el equipamiento de estos laboratorios.
Los sistemas LC que albergan dos canales LC independientes con dos trayectorias de flujo separadas, configurables individualmente en un solo instrumento, son beneficiosas de múltiples maneras. Por ejemplo, el sistema Vanquish Flex Duo recientemente desarrollado para LC dual permite la optimización de cada canal de flujo con respecto a los volúmenes de retardo de columna o gradiente adicionales, dando la oportunidad de tener un instrumento HPLC y un instrumento UHPLC en un solo equipo.
Tal configuración se puede utilizar para la implementación paralela de métodos HPLC y UHPLC completamente independientes, pero también para acelerar los métodos heredados de HPLC en la misma estación de trabajo. Esta aplicación demuestra el último caso.
El canal cromatográfico izquierdo del sistema Vanquish Flex Duo para LC dual se configuró con volúmenes de sistema standard de HPLC y se ejecutó con una columna de diámetro interno de 4,6 mm y tamaño de partículas de 3 µm para el análisis de acetaminofeno como ingrediente farmacéutico activo (API) y sus impurezas derivadas de un ensayo USP.1 Los volúmenes del sistema se redujeron en el canal derecho por el método UHPLC respectivo, desarrollado con el sistema de datos de cromatografía Chromeleon™ (CDS), el cual se ejecutó en paralelo con una columna de i.d. de 2,1 mm y tamaño de partículas de 1,9 µm.
Ambos análisis se realizaron con la fase estacionaria Thermo Scientific™ Hypersil GOLD™ C8 de diferentes dimensiones según USP L7 y muy adecuado para analitos de hidrofobicidad media.
Experimental
Reactivos y Materiales
- Agua desionizada, 18,2 MΩ·cm de resistividad o superior.
- Fisher Scientific™ Metanol Optima™, grado LC/MS (N/P 10767665).
- Fosfato sódico dibásico anhidro Fisher Scientific (P/N 10182863).
- Fosfato de Potasio monobásico Fisher Scientific (P/N 10429570).
- Acetaminofeno, 4-aminofenol, N-(4-hidroxifenil) propanamida (Impureza B), 2-acetamidofenol (Impureza C), acetanilida (Impureza D) y 4′-cloroacetanilida (Impureza J) se compraron a proveedores acreditados.
Preparación de Muestra
Las soluciones madre de acetaminofeno (20 mg/ml), 4-aminofenol y las impurezas B, C, D y J (1 mg/ml cada una) se prepararon en metanol. Por dilución con metanol y mezcla de soluciones madre, se preparó una muestra que contenía 10 mg/ml de acetaminofeno y 10 µg/ml de cada uno de los otros compuestos (correspondientes al 0,1% de la API).
Instrumentación
Sistema Vanquish Flex Duo para LC dual compuesto por:
- Base del sistema Vanquish Dual (N/P VF-S02-A-02).
- Bomba Dual F (N/P VF-P32-A-010).
- Bomba izquierda con mezclador estático, volumen 350 µL (N/P 5310).
- Bomba derecha con mezclador estático, volumen 150 µL (N/P 5110).
- Inyector Split Sampler FT (N/P VF-A40-A-020).
- Compartimiento de Columna H (N/P VH-C10-A-020).
- Detector de longitud de onda variable en la trayectoria de flujo izquierda (N/P VH-D40-A0) con celda de flujo estándar, 10 mm, 11 µL (N/P 0250).
- Detector de longitud de onda variable en la trayectoria de flujo derecha (N/P VH-D40-A0) con celda de flujo semi-micro, 7 mm, 2,5 µL (N/P 0360).
Procesamiento de Datos y Software
Se utilizó el software Chromeleon CDS versión 7.2.8 para la adquisición y análisis de datos.
Resultados y Discusión
La configuración fluídica esquemática del sistema Dual LC se utilizó en este estudio para ejecutar dos canales independientes: un canal HPLC tradicional (izquierda) con volúmenes estándar y un canal UHPLC optimizado (derecha) con volúmenes reducidos.
Los parámetros del método del canal UHPLC se derivaron del método HPLC original mediante la herramienta de aceleración Chromeleon CDS UHPLC con un factor de impulso de 1,52 para un caudal de 0,5 ml/min y un tiempo de descarga adicional para garantizar un equilibrio suficiente. En ambos canales cromatográficos se corrieron 10 inyecciones repetidas de la muestra. La Figura 2 muestra dos ejemplos de cromatogramas con resoluciones promedio (Rs) que cumplen con los requisitos de la USP.1
Precisión y Sensibilidad
Con respecto a la precisión del área de pico y los valores de señal/ruido (S/N), el método UHPLC inicial fue inferior al método HPLC debido a dos impactos. Por un lado, la sensibilidad a los rayos UV se ve afectada por la longitud de la ruta de luz proporcionada por la celda de flujo, que es un 30% más corta para la configuración UHPLC. Además, la precisión de inyección (y, por lo tanto, el área% RSD) se ve afectada negativamente por el muy bajo volumen de inyección de 0,17 µL en el método UHPLC a medida que se acerca al límite de especificación del inyector automático.
Debido a la reducción de escala del menor volumen de la columna de UHPLC, este pequeño volumen de inyección resulta del cálculo automático de parámetros por la calculadora de aceleración Chromeleon CDS, que se origina en un volumen de inyección ya pequeño de solo 1 µL que tuvo que aplicarse en el método original de HPLC.
En el modo HPLC, los volúmenes de análisis superiores a 1 µL causaron formas de pico distorsionadas para el 4-aminofenol de elución temprana debido a la alta resistencia de elución del metanol solvente de la muestra y a la mezcla insuficiente en la columna previa en los bajos volúmenes del sistema.
En contraste, triplicar el volumen de inyección reducido de 0,17 µL a 0,5 µL no causó ninguna alteración de pico para el método UHPLC ya que el volumen de muestra de 0,5 µL es lo suficientemente pequeño como para mezclarse adecuadamente con el entorno de la fase móvil antes de ingresar a la columna. Ambos casos se ilustran en la Figura 4 y demuestran claramente la ventaja del método UHPLC para la capacidad de carga de volumen de muestra.
Optimización del Método UHPLC
Se recomienda una mejora simple del método UHPLC al aumentar el volumen de inyección de 0,17 µL a 0,5 µL para mejorar S/N y rendimientos% de área de RSD en un rango similar al método HPLC. Los tres métodos dieron como resultado picos bien integrables con valores de S/N mayores a 50.
Los beneficios considerables del método UHPLC son ahorros sustanciales en el volumen de muestra, el consumo de solvente, y tiempo de ciclo (tc), con capacidades de optimización adicionales si el volumen de retardo de gradiente y, por lo tanto, el tiempo de equilibrio se reducen aún más, por ejemplo, configurando el sistema Dual LC con una bomba mezcladora de alta presión (HPG) para la ruta UHPLC.
Otra opción para aumentar el rendimiento y ahorrar costos y tiempo es la eliminación del primer paso isocrático de la tabla de gradiente, ya que la columna experimenta un paso isocrático suficientemente largo debido al retraso del gradiente. Los respectivos cromatogramas UHPLC con esta optimización se representan en la Figura 5, y se puede deducir que la resolución del par crítico (pico 3 y 4) se mejora (Rs = 3). Con este método, el tiempo de ejecución podría acortarse en otros 1,2 minutos sin comprometer el% de área de RSD o S/N.
Conclusión
El sistema Vanquish Flex Duo para LC dual brinda la oportunidad de tener un canal HPLC y un canal UHPLC en un solo sistema, ambos trabajando independientemente uno del otro. La aceleración de los métodos de HPLC para pasar a UHPLC se puede realizar fácilmente en la misma estación de trabajo. Ambos canales también se pueden usar de forma independiente para análisis separados.
Métricas de Rendimiento Alcanzadas
En comparación con el análisis de HPLC, el método UHPLC optimizado (sin paso isocrático, volumen de inyección de 0,5 µL) dio como resultado un 50% de ahorro en muestra, 80% de ahorro en solvente y 60% de ahorro en tiempo, con una mejora del rendimiento de 2,5 veces.
Cien muestras podrían analizarse durante un día laboral de 8 horas por UHPLC en lugar de más de 20 horas. Suponiendo costos de $25 por litro de solvente más 10% para eliminación, el cambio a UHPLC implica un ahorro de costos de alrededor de $27 por 100 muestras o $5.400 por año (con una estimación de 20.000 muestras por año).
- Se logró un aumento del rendimiento de 2,5 veces y ahorros de hasta 80% de fase móvil y 60% de tiempo de ciclo al acelerar un método de HPLC a condiciones de UHPLC.
Referencias
- Farmacopea de los Estados Unidos USP40-NF35 S1, Método de acetaminofeno. Convención de la Farmacopea de los Estados Unidos, 2017.
- Franz, H.; Fabel, S.: Nota técnica científica Thermo Fisher 75: Una herramienta universal para la transferencia de métodos de HPLC a UHPLC, 2016. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CMD/Application-Notes/TN-75-HPLC-UHPLC-Universal-Tool-Method-Transfer-TN70828-EN.pdf
Para uso exclusivo en investigación. No debe utilizarse en los procedimientos de diagnóstico.
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Código de Referencia: AN72593-EN | 0218S
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