29 Ene Maximizar la eficiencia con las columnas Agilent InfinityLab Poroshell 120
Columnas Agilent InfinityLab Poroshell 120: 100.000 platos <5min
Columnas Agilent InfinityLab Poroshell 120: máxima eficiencia en cromatografía de líquidos
Por Angelika Gratzfeld-Hüsgen y Edgar Naegele, Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania
Resumen ejecutivo
Las columnas basadas en tecnologías superficialmente porosas son una alternativa a las columnas basadas en partículas de tamaño inferior a 2 µm. La combinación de estas columnas con el sistema LC Agilent 1290 Infinity produce separaciones de alta eficiencia.
Ventajas de las columnas Agilent InfinityLab Poroshell 120:
- Menor retropresión
- Mayor eficiencia
- Capacidad de volumen comparable
Resultado clave: 100.000 platos en menos de 5 minutos con tres columnas acopladas.
Introducción
Recientemente, las columnas de partículas de tamaño inferior a 2 µm han atraído mucho interés debido a su elevada eficiencia. Pueden usarse con velocidades de flujo mayores que las evaluadas según la ecuación de Van Deemter. La pérdida en eficiencia con velocidades de flujo superiores es escasa en comparación con la eficiencia a la velocidad de flujo óptima. Los tiempos de análisis y las duraciones de los ciclos pueden reducirse para obtener resultados más rápidos.
Limitaciones de columnas de <2 µm y alternativa con Poroshell
El inconveniente de estas columnas es que se obtienen retropresiones significativamente más elevadas, debido a los pequeños tamaños de partícula. En numerosos casos, en especial para las columnas largas de menos de 2 µm, los instrumentos de LC deben permitir retropresiones > 400 bar.
La tecnología de partículas superficialmente porosas ofrece una alternativa para análisis de muy alta resolución, debido a que estas columnas muestran una retropresión significativamente inferior. La eficiencia de estas columnas es ligeramente inferior a la de las columnas de partículas de tamaño inferior a 2 µm. Se pueden obtener números de platos muy elevados acoplando columnas, debido a la reducción de la retropresión.
En esta nota de aplicación se demuestra que el acoplamiento de tres columnas largas Agilent InfinityLab Poroshell 120 origina eficiencias extremadamente altas. También se demuestra que la retropresión puede mantenerse por debajo de los 400 bar, a menos que esté disponible un equipo especial de LC. En tal caso, se pueden usar velocidades de flujo superiores para reducir los tiempos de análisis y de equilibrio. Finalmente, se ha realizado una comparación entre una columna con recubrimiento poroso de 2,7 µm y otra con tamaño de partícula inferior a 2 µm.
Metodología experimental
Equipo cromatográfico
Para los experimentos se usó un sistema LC Agilent 1290 Infinity equipado con:
- Bomba binaria
- Muestreador automático
- Compartimento termostatizado de columna
- Detector de diodo array con celda de 10 mm de paso óptico
Columnas evaluadas
- Agilent ZORBAX: Resolución Rápida y Alto Rendimiento, 4,6 mm × 150 mm, 1,8 µm (hasta 600 bar)
- Agilent InfinityLab Poroshell 120: 4,6 mm × 150 mm, 2,7 µm (hasta 600 bar)
Software
Software Agilent ChemStation, versión B.04.02
Resultados y análisis
Ventajas de la tecnología superficialmente porosa
La tecnología de columna superficialmente porosa se basa en partículas con un núcleo sólido y un recubrimiento superficialmente poroso:
- Núcleo sólido: 1,7 µm
- Recubrimiento poroso de sílice: 0,5 µm
- Tamaño total de partícula: ~2,7 µm
Comparadas con partículas completamente porosas de <2 µm, las partículas superficialmente porosas de 2,7 µm proporcionan:
- Retropresión: 40–50% inferior
- Eficiencia: 80–90% de la eficiencia de <2 µm
- Distribución de tamaño: Más estrecha y más homogénea
- Resistencia a transferencia de masa: Menor, permitiendo mayores velocidades de flujo sin pérdida de eficiencia
Configuración experimental
Se evaluaron columnas Agilent InfinityLab Poroshell 120 (diámetro 4,6 mm, longitud 150 mm) mediante:
- Evaluación del número de platos de una sola columna a 1,5 ml/min
- Evaluación del número de platos para tres columnas acopladas a 1,5 ml/min
- Evaluación del número de platos para tres columnas acopladas a velocidades de flujo mayores
- Precisión de los tiempos de retención usando condiciones isocráticas y en gradiente
- Comparación entre columna con recubrimiento poroso y columna con partículas de <2 µm
Cálculo de eficiencia (número de platos)
La eficiencia de la columna se mide en condiciones isocráticas. Para picos simétricos, el número de platos (N) se calcula según:
N = 5,54 (TR/W)²
Donde TR es el tiempo de retención y W es la anchura de pico a la mitad de la altura.
Evaluación del rendimiento de columnas individuales
Para evaluar el número de platos en una sola columna, se usaron compuestos de referencia: uracilo, acetofenona, benceno y tolueno.
Resultado: Aproximadamente 35.000 platos/columna para tolueno en las condiciones cromatográficas especificadas, equivalente a más de 235.000 platos/metro.
Evaluación de tres columnas acopladas: ultra alta eficiencia
Teóricamente, tres columnas de 35.000 platos deberían proporcionar ~105.000 platos totales. El acoplamiento se realizó utilizando capilares de acero inoxidable (90 × 0,12 mm).
Rendimiento a diferentes velocidades de flujo
Se evaluó el número de platos para diferentes velocidades de flujo con un límite de retropresión de 400 bar para sistemas LC estándar (hasta 1.200 bar para sistemas de alta presión):
- 1,0 ml/min (400 bar): ~80.000 platos
- 1,5 ml/min: ~103.000 platos (próximo al valor teórico de 105.000)
- 1,8 ml/min: ~115.000 platos (mejor resultado), tiempo de retención <5 minutos
Conclusión clave: 100.000+ platos en menos de 5 minutos sin exceder 600 bar de retropresión.
Para valores de factor de capacidad (k’) más altos, se obtuvieron buenos resultados utilizando tres columnas acopladas a 1,2 ml/min.
Precisión analítica en condiciones isocráticas
Se evaluó la precisión de las condiciones isocráticas a 1,5 ml/min con seis análisis consecutivos:
- Precisión de tiempos de retención: <0,034% RSD
- Precisión de áreas: <0,66% RSD (excepto uracilo)
Precisión analítica en condiciones de gradiente
Se evaluó la precisión para análisis en gradiente usando un gradiente del 35 al 95% en 10 minutos con seis inyecciones consecutivas:
- Precisión de tiempos de retención: RSD <0,04% (excepto tiourea)
- Precisión de áreas de picos: <0,38% RSD para inyección de 1 µl
Evaluación: Excelente precisión en ambas condiciones, demostrando reproducibilidad y confiabilidad del sistema.
Comparación: Poroshell 120 vs. partículas <2 µm
Capacidad de picos
Se compararon dos columnas de 150 × 4,6 mm de diámetro interno analizando un conjunto de 10 compuestos:
- Columna InfinityLab Poroshell 120: 133 picos detectados (capacidad superior)
- Columna <2 µm: 101 picos detectados
- Ventaja Poroshell: ~30% mayor eficiencia
La columna Poroshell 120 muestra menores tiempos de elución y menor anchura de pico, lo que origina mayor capacidad de picos gracias a la menor anchura y mejor separación.
Capacidad de volumen
Se probó la capacidad de volumen inyectando una muestra concentrada (10 µl, ~20 µg):
Resultado: No se observaron diferencias significativas entre columnas. La anchura de pico para InfinityLab Poroshell 120 fue algo inferior debido a la elución más temprana, típicamente más pequeña en esta tecnología.
Comparación de relación señal-ruido (S/N)
Se analizaron impurezas en un fármaco (rango 0,02–0,03%) para evaluar S/N con ambas columnas:
Resultado: Las impurezas 1 y 2 mostraron S/N comparables entre ambas tecnologías, con ventajas ligeramente superiores para la columna Poroshell bajo estas condiciones.
Conclusiones
Las columnas con recubrimiento poroso Agilent InfinityLab Poroshell 120 representan una alternativa real y superior a las columnas de partículas <2 µm en muchas aplicaciones:
- Eficiencia individual: Una columna de 4,6 × 150 mm, 2,7 µm proporciona 35.000 platos a 1 ml/min sin superar 400 bar (235.000 platos/metro)
- Ultra alta eficiencia: Tres columnas acopladas producen 100.000+ platos en <5 minutos sin superar 600 bar
- Precisión analítica: Excelentes datos de precisión para análisis isocrático (<0,034% RSD) y en gradiente (<0,04% RSD)
- Tiempos de elución: Menores que columnas similares de <2 µm, generando picos más estrechos y mayor capacidad de picos
- Ventaja de capacidad: ~30% mayor eficiencia y mejor resolución en comparación directa
Recomendación: La tecnología Poroshell 120 es ideal para laboratorios que requieren máxima eficiencia, tiempos de análisis rápidos y sistemas de presión moderada.
Referencias
- Cunliffe, J. M.; Maloney, T. D. Fused-core particle technology as an alternative to sub-2-µm particles to achieve high separation efficiency with low backpressure. J. Sep. Sci. 2007, 30, 3104-3109.
- Griiti, F.; et al. Comparison between the efficiencies of columns packed with fully and partially porous C18-bonded silica materials. J. of Chromatog. A 2007, 1157, 289-303.
Más información: www.agilent.com
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