HPLC fase reversa: guía de troubleshooting de columnas

Esta guía de resolución de problemas cubre los problemas más comunes encontrados en cromatografía de fase reversa y cómo solucionarlos. Se abordan cuatro áreas principales:

• Forma de los picos
• Cambios en el tiempo de retención
• Picos fantasma
• Problemas relacionados con la contrapresión de la columna

Además se incluye una guía de cuidado de columnas.

1. Forma de pico

1.1. Tailing de picos (cola de picos)

El tailing ha sido el problema más común de forma de picos desde los primeros días de la cromatografía en fase reversa. La mayor parte se debe a la interacción con grupos silanol ácidos o ionizados en la superficie de las partículas de sílice. La sílice de baja pureza (tipo A) tiene un alto contenido de grupos silanol ácidos (-Si-OH) y la presencia de impurezas metálicas (especialmente hierro y aluminio) aumenta la ionización de estos grupos a -Si-O⁻, que proporciona sitios de intercambio de cationes. El pKa de estos materiales se encuentra en la región de pH 4–5, por lo que a pH > 6 la mayoría de los grupos silanol están ionizados.

Los esfuerzos por mejorar la pureza condujeron a las partículas de sílice de mayor pureza (tipo B), cuyo pKa es > 8, lo que minimiza la ionización del silanol en el rango estable de pH 2–8 de la mayoría de las columnas.

Los compuestos básicos son los más susceptibles al silanol tailing. La Figura 1 ilustra este efecto: el tolueno (compuesto neutro) no presenta tailing, pero los fármacos fuertemente básicos sí lo hacen. La sílice tipo A (Fig. 1a) tiene interacciones tan fuertes que los analitos no eluyen; los primeros materiales tipo B (Fig. 1b) mejoran la forma de los picos aunque persiste cola; las mejoras posteriores en pureza (Fig. 1c) reducen el tailing a niveles aceptables. El tailing de silanol se reduce mejor usando sílice de alta pureza. La trietilamina (TEA, 25 mM) en la fase móvil fue durante años una alternativa eficaz, pero con la sílice de alta pureza actual ya no es necesaria.

Posibles soluciones:

1. Utilizar columna con relleno de sílice de alta pureza.
2. Agregar 25 mM de trietilamina (TEA) en la fase móvil.

1.2. Buffer o aditivo de fase móvil insuficientes

Un buffer insuficiente en la fase móvil también puede producir tailing. La función principal del tampón es mantener la muestra en un estado de ionización constante para estabilizar la retención y minimizar la cola por interacciones iónicas. El tampón además suprime la ionización de los grupos silanol en la sílice, lo que es especialmente importante en materiales de menor pureza.

La Figura 2 ilustra el efecto de la concentración del aditivo (TFA) sobre la forma de los picos en una separación de proteínas. El TFA al 0,1% es suficiente para minimizar el tailing tanto en sílice de alta como de moderada pureza (Fig. 2a y 2b). Al reducir la concentración de TFA diez veces (Fig. 2c y 2d), el tailing aumenta en ambos casos; la sílice de alta pureza sigue manteniendo una forma de pico aceptable, pero la sílice de pureza moderada resulta inaceptable.

Posibles soluciones:

1. Agregar entre 10 y 25 mM de TFA a la fase móvil.

1.3. Distorsión de todos los picos del cromatograma

Cuando todos los picos muestran el mismo tipo de distorsión (Fig. 3), el problema suele ser físico, no químico. La causa más común es una frita parcialmente bloqueada o un vacío en la cabeza de la columna. Las partículas de muestra, las juntas de bomba desgastadas o impurezas de la fase móvil se acumulan en la frita y distorsionan la distribución de la muestra en la entrada de la columna, de manera que una parte de la muestra llega por una vía de flujo diferente. Como no se ha producido separación en este punto, todos los analitos se distorsionan de la misma manera.

Posibles soluciones:

1. Filtrar la fase móvil y las muestras con filtros de 0,22 o 0,45 µm.
2. Cambiar periódicamente las juntas de la bomba.
3. Utilizar un filtro en línea.

1.4. Picos mal resueltos

Dos picos parcialmente resueltos pueden aparentar ser un problema de columna o buffer. La Figura 4a muestra una distorsión similar a la de la Figura 3, lo que sugería una frita bloqueada; sin embargo, el cambio de columna no corrigió el problema. Al reducir la masa de muestra en la columna (Fig. 4b), el pico se reconoció como dos picos solapados. Se modificaron las condiciones del método para lograr la separación completa.

1.5. Picos frontales

Los picos frontales son poco frecuentes en columnas bien empaquetadas. Una causa posible es la canalización o el colapso de la estructura de la columna, poco común si se utilizan las condiciones recomendadas por el fabricante.

La mayoría de las columnas de sílice son estables en el rango de pH 2–8. Por debajo de pH 2 se hidroliza la fase enlazada; por encima de pH 8 puede disolverse la sílice. Si es necesario operar fuera de este rango, seleccione una columna diseñada específicamente para esas condiciones.

Posibles soluciones:

1. Utilizar la columna en el rango de pH 2–8.
2. Si se requieren otras condiciones, elegir una columna diseñada para alto o bajo pH, o para alta concentración de agua.

2. Variación en la retención

Cuando todos los picos cambian los tiempos de retención, lo más probable es que se deba a un cambio en la composición de la fase móvil, el relleno de la columna, la temperatura o el caudal. Los errores en la mezcla en línea de fases móviles isocráticas o de gradiente también pueden causar estos problemas.

2.1. Cambios en la composición de la fase móvil

Suelen producirse de forma brusca por un ajuste incorrecto del sistema de mezcla en línea, por la sustitución de la fase móvil con un nuevo lote mal preparado, o en raras ocasiones por la pérdida selectiva de un componente (p. ej., por evaporación). Cuando se produce un cambio de fase móvil, los picos suelen moverse en la misma dirección —a tiempos de retención más cortos o más largos— y la selectividad relativa (factor α) suele verse afectada.

Posibles soluciones:

1. Revisar los ajustes del sistema y preparar nueva fase móvil si es necesario.
2. Probar la columna en otro equipo para descartar un problema en ella.
3. Verificar el correcto funcionamiento del equipo.

2.2. Cambios químicos de la columna

El envejecimiento de la columna suele ser gradual a lo largo de semanas o meses, y va acompañado de un aumento de la contrapresión, cambio gradual de los tiempos de retención y mayor tailing. Cambiar la columna por una nueva confirma si el problema es de envejecimiento. Una vida útil de 500 a 2.000 inyecciones debería considerarse satisfactoria.

Posibles soluciones:

1. Verificar las condiciones de uso para la columna en cuestión y comprobar si corresponden con sus características.

2.3. Cambios de temperatura de la columna

Un cambio de 1 °C puede provocar variaciones del tiempo de retención de entre un 1% y un 3%. Sin horno de columna, la temperatura varía a lo largo del día por las condiciones del laboratorio.

Posible solución:

1. Utilizar un horno de columna o controlar la temperatura ambiente con frecuencia.

2.4. Problemas de caudal

Los problemas de caudal pueden deberse a burbujas, fugas o fallas de la bomba. Las burbujas se correlacionan con presión baja o fluctuante y aumento de los tiempos de retención; con bombas de dos cabezales, el flujo y la presión pueden pulsar si hay una burbuja en un solo cabezal.

Posibles soluciones — burbujas:

1. Desgasificar la fase móvil y purgar el sistema con un flujo de 5–10 ml/min.
2. Si el problema persiste, utilizar acetonitrilo o metanol puro para el purgado.

Las fugas también aumentarán los tiempos de retención. Busque accesorios que goteen o depósitos cristalinos en los conectores como evidencia de fugas, prestando especial atención a los situados aguas arriba de la columna. Los conectores del interior del automuestreador pueden ser difíciles de inspeccionar; una linterna y un pequeño espejo pueden ser útiles. Para conectores de acero inoxidable, un giro de ¼ de tuerca suele detener la fuga. Para racores PEEK, detenga la bomba, afloje el racor, empuje el tubo hasta el fondo del puerto y luego apriete antes de reanudar el flujo. Apretar un racor PEEK con flujo activo puede crear volumen extracolumna que degrade la separación. Si la fuga proviene de válvulas, consulte con el servicio técnico.

Posible solución — fugas:

1. Buscar posibles fugas en el equipo y, si es necesario, consultar con el servicio técnico.

3. Picos fantasma

3.1. Elución tardía de corridas anteriores

En separaciones isocráticas, un compuesto de dilución tardía de una inyección anterior puede aparecer como un pico inesperadamente ancho entre picos estrechos (ver Figura 11, flecha).

Posibles soluciones:

1. Extender el tiempo entre inyecciones entre 2 y 3 veces, o hasta verificar que el pico en cuestión haya eluido.
2. Agregar un lavado con solvente fuerte al final de cada inyección.

3.2. Picos fantasma en gradientes

Para aislar picos fantasma en gradientes, ejecute un gradiente en blanco sin inyección y observe la línea de base. Si aparecen picos excesivos (Fig. 12a), la causa más probable son reactivos contaminados. Las impurezas no polares de la fase móvil se concentran en la cabeza de la columna durante el equilibrio y eluyen durante el gradiente como cualquier otro pico.

Para identificar la fuente, amplíe el período de equilibrio tres veces: si los picos del gradiente en blanco aumentan aproximadamente tres veces, el solvente acuoso es la fuente más probable. Sustituya el agua y/o los aditivos por componentes de mayor pureza para eliminar el problema (Fig. 12b).

3.3. Picos negativos

Los picos negativos son menos comunes que los positivos, pero pueden ocurrir, especialmente en métodos con emparejamiento de iones u otros reactivos de fase móvil con absorbancia UV significativa. La absorbancia de fondo puede ser considerable, pero no se nota porque el sistema pone en cero la señal al inicio de cada serie. Cualquier compuesto con menor absorbancia que el fondo aparecerá como pico negativo. La identificación y eliminación de la fuente se realiza igual que para los picos positivos.

Posible solución:

1. Comprobar la calidad del agua y los reactivos utilizados.

4. Contrapresión en la columna

El aumento de contrapresión es inevitable con el envejecimiento de la columna y es una de las causas más comunes de fallo. Algunas prácticas sencillas ayudan a prolongar la vida útil: uso de filtros en línea (4.2), cartuchos guardacolumna (4.3) y lavado regular de la columna (5.2).

4.1. Localizar problemas de presión

Si se utiliza un filtro en línea, compruébelo primero. De lo contrario, afloje sistemáticamente los conectores empezando por la salida del HPLC y avanzando hacia la bomba. Cada elemento retirado debería producir un cambio insignificante en la caída de presión, excepto la columna. Al retirar la columna la presión caerá; use la información histórica de presión normal para determinar si la columna es la fuente del problema. Una vez identificada, sustituya la tubería afectada o realice un lavado a contracorriente de la parte obstruida (ver 5.2).

4.2. Filtros en línea

Los filtros en línea son una de las herramientas más económicas y eficaces para prolongar la vida útil de las columnas. Contienen una frita de 0,5 µm y se montan después del automuestreador para atrapar partículas de la fase móvil, la bomba, el automuestreador o la muestra. No sustituyen la filtración del solvente ni otras prácticas preventivas, sino que sirven como respaldo. Se recomienda su uso en todos los sistemas, incluso cuando se utilice cartucho guardacolumna.

4.3. Cartuchos guardacolumna

Los cartuchos guardacolumna proporcionan una doble protección. La frita de la cabeza del cartucho atrapa partículas y la fase estacionaria del cartucho adsorbe irreversiblemente las sustancias que dañarían la columna analítica. Un aumento del 10% en la presión del sistema (no corregido por el filtro en línea), o una caída del 10% en eficiencia o resolución, indican que el cartucho debe sustituirse. La Figura 13 ilustra la eficacia de los cartuchos guardacolumna.

4.4. Precipitación de buffer

La precipitación de buffer es una causa común de aumento de contrapresión en cromatografía de fase reversa con alta concentración de solvente orgánico. Para intentar eliminar el buffer precipitado, invierta la columna y bombee entre 20 y 40 volúmenes de columna de agua al 100% a flujo reducido. Si tiene éxito, restablezca la dirección de flujo y lave con 10–20 volúmenes de agua/solvente orgánico 50:50, seguido de 10–20 volúmenes de solvente orgánico al 100%, y finalmente reequilibre en las condiciones deseadas.

Para evitar repetición: verifique la compatibilidad de la fase móvil con la concentración de buffer usada, reduzca la fuerza iónica si es necesario, aumente el porcentaje de agua y considere premezclar la fase móvil. En fase reversa, evite los cambios rápidos de la fase móvil con buffer al 100% de solvente orgánico (MeOH, ACN).

5. Cuidado de la columna

Las columnas son elementos consumibles con vida útil limitada. En la mayoría de las aplicaciones duran entre 500 y 2.000 inyecciones, dependiendo de la limpieza de las muestras, el pH de la fase móvil y el uso de cartuchos de protección.

5.1. Equilibrio de la columna

Al cambiar de fase móvil o reciclar un gradiente, el equilibrio debe tomar entre 10 y 20 volúmenes de columna. Cuanto menos drástico sea el cambio de solvente, menos volumen se necesitará. Para verificar el equilibrio, realice dos inyecciones consecutivas: si la retención es idéntica, la columna está equilibrada; si se desplaza, aumente el volumen de equilibrio. El equilibrio depende del volumen de solvente, no del tiempo, por lo que un mayor caudal reduce el tiempo necesario.

5.2. Lavado habitual de la columna

Al final de cada día de uso, elimine cualquier buffer (ver 4.4) y lave la columna con el 100% del solvente fuerte (generalmente ACN o MeOH para métodos de fase reversa). Evitar la deshidratación de la fase impedirá problemas en el reequilibrio posterior.

Lavado para regeneración de la columna

Siga este procedimiento general con los solventes específicos indicados para cada tipo de columna. Compruebe siempre las recomendaciones del fabricante antes de lavar.

1. Desconectar e invertir la columna.
2. Conectar la columna a la bomba, pero no al detector.
3. Lavar con 10–20 volúmenes de solvente a un caudal no superior al utilizado en el cromatograma de control de calidad.
4. Asegurarse de utilizar solventes miscibles entre sí en pasos sucesivos.

5.2.1. Columnas de fase reversa (C18, C8, C4, Fenil, CN, tipo “AQ”)

1. Fase móvil sin buffer.
2. MeOH o ACN.

Si se sospecha contaminación por iones metálicos: lavar con EDTA acuoso 0,05 M, luego con agua, y continuar con la secuencia anterior. Las columnas con reactivos de emparejamiento de iones deben dedicarse exclusivamente a esas aplicaciones.

5.2.2. Columnas de proteínas/péptidos en fase reversa

1. Fase móvil sin buffer.
2. Gradiente de 10–90% B; A = 0,1% TFA/agua; B = 0,1% TFA/ACN.

5.2.3. Columnas de sílice sin aglutinar (SIL)

1. IPA
2. MeOH
3. Acetato de etilo

5.2.4. Columnas de fase normal enlazadas (CN, NH₂, Diol)

1. Cloroformo
2. IPA
3. Cloruro de metileno
4. Hexano

5.2.5. Columnas de intercambio aniónico (SAX, WAX)

1. Agua
2. Metanol
3. Cloroformo
4. Metanol
5. Agua

5.2.6. Columnas de intercambio catiónico (SCX, WCX)

1. Agua (inyectar 4× 200 µL de DMSO durante el lavado).
2. THF

5.2.7. Columnas de exclusión por tamaño para proteínas

Para proteínas débilmente retenidas: tampón fosfato 0,1 M, pH 3.
Para proteínas fuertemente retenidas:

1. Gradiente de 100% agua a 100% ACN en 60 min.

5.3. Almacenamiento de la columna

Elimine cualquier buffer de la columna (ver 4.4) y lave con 10–20 volúmenes de solvente fuerte (p. ej., MeOH o ACN para fase reversa, según 5.2) para eliminar el material fuertemente retenido. Luego enjuague con 10–20 volúmenes del solvente de almacenamiento especificado por el fabricante (indicado en el cromatograma de prueba de QC original) y tape la columna de forma segura para evitar la evaporación.

Salvo indicación contraria del fabricante, no almacene las columnas con buffer ni con menos de un 25% de solvente orgánico para evitar el crecimiento microbiano.

6. Resumen

Se han examinado las causas más comunes de problemas de forma de picos, variación del tiempo de retención, picos fantasma y contrapresión de columna. Algunos buenos hábitos ayudarán a minimizar su aparición:

• Utilizar una columna de sílice tipo B de alta pureza para cada nuevo proyecto, con reactivos de alta calidad.
• Lavar el sistema HPLC con regularidad para eliminar sales y buffers, y realizar el mantenimiento periódico del sistema para minimizar problemas con válvulas de retención y sellos de bomba.
• Al final de cada serie (o después de cada corrida, según el caso), lavar con solvente fuerte para eliminar materiales fuertemente retenidos, minimizar interferencias futuras y prolongar la vida útil de la columna.

Las columnas no duran indefinidamente, pero con un cuidado adecuado es posible obtener un buen rendimiento durante toda su vida útil.

Seguir leyendo:

• Soluciones para una preparación de muestras sin preocupaciones
• Columnas para HPLC analítica ZORBAX Eclipse Plus Agilent
• Productos de Filtración Agilent Captiva