24 Ago Método analítico para la determinación de HAP en la infusión de yerba mate
HAP en yerba mate: detección por GC-TOFMS y QuEChERS
Los hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) son compuestos tóxicos que se encuentran en algunos alimentos, en especial aquellos cuya preparación atraviesa un proceso ahumado, asado, grillado, o de secado. Existe un interés especial por la infusión de yerba mate (Ilex paraguariensis), debido a niveles relativamente altos de HAP y a su asociación aparente con problemas de salud.
Si bien los clásicos métodos de extracción de muestras arrojan excelentes resultados para detectar HAP en infusiones, estas técnicas exigen mucho tiempo y dinero. Se ha desarrollado un método de extracción QuEChERS modificado y de extracción en fase sólida (SPE) sobre sílice para la limpieza de muestras, que emplea menos recursos y alcanza una buena recuperación cuantitativa de HAP en la infusión de yerba mate. La separación cromatográfica de los compuestos HAP4 de la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) y de las interferencias isobáricas se optimizó en una fase estacionaria con alto contenido de fenilo empleando GC-TOFMS con gas transportador de hidrógeno y GC-MS/MS. La comparación de los valores de HAP obtenidos y determinados mediante GC-TOFMS y GC-MS/MS, fue favorable. Los niveles totales de los compuestos HAP4 de EFSA resultaron relativamente altos en relación con otros alimentos, arrojando una variación de 200 a 800 ng/g en la infusión seca.
Introducción
La yerba mate es muy popular en Argentina, Brasil, Paraguay y Uruguay, y su historia data de mucho tiempo en algunas culturas; aún hoy el mate se comparte entre varias personas como demostración de hospitalidad [1]. La importancia económica del mate aumenta a medida que se introducen en todo el mundo productos fabricados a partir del mate y su infusión. Su creciente popularidad se debe, en parte, a su reputación de brindar numerosos beneficios para la salud, que incluyen mayor energía y pérdida de peso, como así también para el tratamiento de varios problemas de salud, desde dolores de cabeza hasta hipertensión [2-7]. Sin embargo, existe una alta incidencia de cáncer esofágico en poblaciones que presentan un alto consumo de esta infusión, lo que sugiere un posible vínculo entre el mate y el cáncer [8-20]. Algo que debemos tener en cuenta son los niveles relativamente altos de HAP en la infusión de mate, que probablemente se deban a su proceso de secado en llamas u otro método similar [8].
Los hidrocarburos aromáticos policíclicos se forman durante el proceso de combustión, lo que despierta preocupación ya que algunos son tóxicos para el hombre. Los alimentos constituyen una vía común de exposición para los humanos, por lo que existen algunas reglamentaciones para ciertos alimentos y HAP específicos [21]. En el pasado se solía utilizar el benzo[a]pireno como único marcador de toxicidad. Sin embargo, los datos han demostrado la existencia de HAP tóxicos en los alimentos sin la presencia de benzo[a]pireno. La revisión realizada por la EFSA sugirió el monitoreo de al menos un subgrupo de cuatro HAP, HAP4, y de ocho HAP, HAP8, en los alimentos [21]. Los compuestos del grupo HAP4 incluyen benzo[a]pireno, criseno, benzo[a]antraceno y benzo[b]fluoranteno. El subgrupo HAP8 consiste en el grupo HAP4 además de benzo[k]fluoranteno, indeno[1,2,3-cd]pireno, dibenz[ah]antraceno y benzo[ghi]perileno. El desarrollo de métodos analíticos para detectar HAP debería ahora centrarse en estos subgrupos.
El análisis de los HAP es complejo debido a la existencia de HAP isobáricos que interfieren con los HAP de interés, lo que hace que la obtención precisa de una determinación cuantitativa resulte difícil, si no imposible de lograr. Por ejemplo, el criseno es un HAP tóxico y forma parte del grupo HAP4, pero su análisis se torna complejo debido a la presencia de trifenileno, una interferencia isobárica que se coeluye de forma completa o parcial al utilizar la cromatografía de gas. Esto provoca un sesgo en la concentración de criseno u obliga a elaborar un informe de los compuestos de manera conjunta. El problema es que el criseno es tóxico pero el trifenileno no lo es, por lo que a menudo se termina exagerando la toxicidad de los productos alimenticios. Por lo tanto, resulta esencial optimizar dicha separación y resolver los compuestos isobáricos a fin de brindar datos cuantitativos correctos para los compuestos de los grupos HAP4 y HAP8, que se emplean como marcadores de toxicidad.
El análisis de los HAP en productos alimenticios también presenta un desafío dado que los compuestos se deben determinar a niveles traza. Con frecuencia se realiza una preparación rigurosa de la muestra, que insume mucho tiempo, a fin de poder extraer los HAP, e incluye la limpieza de la muestra antes de su análisis. La naturaleza compleja de la infusión de mate ha llevado a los investigadores a utilizar exhaustivas preparaciones de muestras, entre las que podemos incluir la extracción con fluidos supercríticos [22], la extracción con fluidos presurizados [8] y la cromatografía de filtración en gel [23-25].
Los métodos de preparación de muestras QuEChERS son una alternativa atractiva, dado que son rápidos, fáciles y brindan resultados de calidad. Por lo general, estos métodos funcionan porque se los realiza junto con técnicas basadas en la espectrometría de masa, tal como la espectrometría de masa en tándem. Generalmente, el método QuEChERs consiste en una extracción de muestra seguida por una limpieza de la extracción en fase sólida dispersiva [26, 27]. Si bien al inicio el método QuEChERS fue diseñado para residuos de pesticidas en frutas y verduras [26], muchas modificaciones se han implementado a fin de ampliar su alcance original. En la actualidad también se evalúan otros compuestos como los HAP, los fármacos de uso veterinario, y los contaminantes orgánicos persistentes, que pueden emplear el método QuEChERS, y se han utilizado métodos similares a QuEChERS para evaluar productos básicos como té, especias y tabaco [28-40].
Este artículo describe el desarrollo de un método analítico para la determinación de HAP en infusiones, que permite a los analistas caracterizar los HAP objetivo de manera más rápida y precisa. La preparación de la muestra se basa en la extracción de QuEChERS modificada y en la limpieza de la muestra por extracción en fase sólida. Se emplearon las técnicas GC-TOFMS y GC-MS/MS y se optimizaron los análisis para resolver los compuestos isobáricos y lograr un tiempo de análisis razonable.
Técnica experimental
Materiales
El desarrollo de este método analítico para la determinación de HAP en las infusiones empleó seis marcas de yerba disponibles en el mercado. Todos los solventes fueron de grado LC-MS o superior. Los patrones y las fuentes de referencia fueron las siguientes: mezcla de HAP método EPA 8310, que contiene 18 HAP (cat.# 31874, Restek Corporation); 5-metilcriseno, benzo
Los hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) son compuestos tóxicos presentes en algunos alimentos, en especial aquellos cuya preparación atraviesa un proceso ahumado, asado, grillado o de secado. Existe un interés especial por la infusión de yerba mate (Ilex paraguariensis), debido a niveles relativamente altos de HAP y a su aparente asociación con problemas de salud.
Si bien los métodos clásicos de extracción arrojan excelentes resultados para detectar HAP en infusiones, estas técnicas exigen mucho tiempo y recursos. Se desarrolló un método de extracción QuEChERS modificado combinado con extracción en fase sólida (SPE) sobre sílice para la limpieza de muestras, que emplea menos recursos y alcanza una buena recuperación cuantitativa de HAP en la infusión de yerba mate. La separación cromatográfica de los compuestos HAP4 de la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) y de las interferencias isobáricas se optimizó en una fase estacionaria con alto contenido de fenilo empleando GC-TOFMS con gas transportador de hidrógeno y GC-MS/MS. La comparación de los valores de HAP obtenidos por ambas técnicas fue favorable. Los niveles totales de los compuestos HAP4 de EFSA resultaron relativamente altos en relación con otros alimentos, con una variación de 200 a 800 ng/g en la infusión seca.
Introducción
La yerba mate es muy popular en Argentina, Brasil, Paraguay y Uruguay, y su historia data de mucho tiempo en algunas culturas; aún hoy el mate se comparte entre varias personas como demostración de hospitalidad [1]. La importancia económica del mate aumenta a medida que se introducen en todo el mundo productos fabricados a partir del mate y su infusión. Su creciente popularidad se debe, en parte, a su reputación de brindar numerosos beneficios para la salud, que incluyen mayor energía y pérdida de peso, como así también para el tratamiento de varios problemas de salud, desde dolores de cabeza hasta hipertensión [2-7]. Sin embargo, existe una alta incidencia de cáncer esofágico en poblaciones con alto consumo de esta infusión, lo que sugiere un posible vínculo entre el mate y el cáncer [8-20]. Un factor a considerar son los niveles relativamente altos de HAP en la infusión de mate, que probablemente se deban a su proceso de secado en llamas u otro método similar [8].
Los hidrocarburos aromáticos policíclicos se forman durante el proceso de combustión, lo que despierta preocupación ya que algunos son tóxicos para el hombre. Los alimentos constituyen una vía común de exposición, por lo que existen reglamentaciones para ciertos alimentos y HAP específicos [21]. En el pasado se solía utilizar el benzo[a]pireno como único marcador de toxicidad. Sin embargo, los datos han demostrado la existencia de HAP tóxicos en los alimentos sin la presencia de benzo[a]pireno. La revisión realizada por la EFSA sugirió el monitoreo de al menos un subgrupo de cuatro HAP (HAP4) y de ocho HAP (HAP8) en los alimentos [21]. Los compuestos del grupo HAP4 incluyen benzo[a]pireno, criseno, benzo[a]antraceno y benzo[b]fluoranteno. El subgrupo HAP8 consiste en el grupo HAP4 más benzo[k]fluoranteno, indeno[1,2,3-cd]pireno, dibenz[ah]antraceno y benzo[ghi]perileno. El desarrollo de métodos analíticos para detectar HAP debería centrarse en estos subgrupos.
El análisis de los HAP es complejo debido a la existencia de HAP isobáricos que interfieren con los HAP de interés, dificultando una determinación cuantitativa precisa. Por ejemplo, el criseno es un HAP tóxico del grupo HAP4, pero su análisis se complica por la presencia de trifenileno, una interferencia isobárica que coeluye de forma completa o parcial en cromatografía de gas. Esto provoca un sesgo en la concentración de criseno u obliga a informar los compuestos de manera conjunta. El problema es que el criseno es tóxico pero el trifenileno no lo es, por lo que a menudo se termina exagerando la toxicidad de los productos alimenticios. Por lo tanto, resulta esencial optimizar la separación y resolver los compuestos isobáricos para obtener datos cuantitativos correctos de los grupos HAP4 y HAP8 como marcadores de toxicidad.
El análisis de los HAP en productos alimenticios también presenta desafíos porque los compuestos deben determinarse a niveles traza. Con frecuencia se requiere una preparación rigurosa de la muestra para extraer los HAP e incluir la limpieza antes del análisis. La naturaleza compleja de la infusión de mate ha llevado a los investigadores a utilizar exhaustivas preparaciones de muestras, entre ellas la extracción con fluidos supercríticos [22], la extracción con fluidos presurizados [8] y la cromatografía de filtración en gel [23-25].
Los métodos de preparación QuEChERS son una alternativa atractiva por ser rápidos, fáciles y de calidad. En general, funcionan combinados con técnicas de espectrometría de masa en tándem. El método QuEChERS consiste en una extracción de muestra seguida por una limpieza de extracción en fase sólida dispersiva [26, 27]. Si bien fue diseñado originalmente para residuos de pesticidas en frutas y verduras [26], numerosas modificaciones han ampliado su alcance. Actualmente se evalúan también HAP, fármacos de uso veterinario y contaminantes orgánicos persistentes mediante este método, y se han aplicado enfoques similares a té, especias y tabaco [28-40].
Este artículo describe el desarrollo de un método analítico para la determinación de HAP en infusiones que permite caracterizar los HAP objetivo de manera más rápida y precisa. La preparación de la muestra se basa en la extracción QuEChERS modificada y en la limpieza por SPE sobre sílice. Se emplearon las técnicas GC-TOFMS y GC-MS/MS, optimizadas para resolver los compuestos isobáricos y lograr un tiempo de análisis razonable.
Técnica experimental
Materiales
El desarrollo de este método analítico empleó seis marcas de yerba disponibles en el mercado. Todos los solventes fueron de grado LC-MS o superior. Los patrones y fuentes de referencia fueron: mezcla de HAP método EPA 8310 con 18 HAP (cat.# 31874, Restek Corporation); 5-metilcriseno, benzo[c]fenantreno, benzo[j]fluoranteno, ciclopenta[cd]pireno y dibenzo[a,e]pireno (Cerilliant); coroneno, dibenz[a,c]antraceno, perileno y trifenileno (Sigma-Aldrich); benzo[e]pireno (Ultra Scientific); benzo(ghi)fluoranteno y benzo[a]fluoranteno (Santa Cruz Biotechnology). Si bien se evaluaron 30 HAP, se prestó especial atención a los grupos HAP4* y HAP8. La mezcla de patrones internos fue SV (cat.# 31206, Restek Corporation). También se utilizaron de Restek Corporation sales de extracción QuEChERS originales sin búfer (cat.# 23992) y cartuchos SPE con fritas de PTFE de 500 mg de sílice (cat.# 24036).
Preparación de la muestra y extracción QuEChERS modificada
La infusión seca se molió con una mezcladora manual. La extracción QuEChERS requiere que la muestra tenga un alto contenido de agua (>80%). Para preparar el material seco, por cada gramo de infusión en polvo se agregaron 10 ml de agua en un tubo de FEP. Tras agitar bien la mezcla, se agregaron los HAP y los patrones internos. Se fortificaron los HAP a 50 y 500 ng/g de infusión seca y se agregaron los patrones internos a 100 ng/g. Las muestras se maceraron 10 minutos y luego se agregaron 10 ml de hexano:acetona (1:1, v/v). Posteriormente, se agitaron las muestras 30 minutos y se agregaron lentamente las sales de QuEChERS preenvesadas sin búfer (4 g MgSO4 y 1 g NaCl). Las muestras se agitaron manualmente 1 minuto y se centrifugaron 5 minutos a 3.000 x g. Se investigaron los solventes de extracción para determinar si el uso de acetonitrilo o hexano:acetona (1:1, v/v) ofrecía mejores recuperaciones. Se fortificaron dos gramos de infusión en polvo con 18 HAP a 50 µg/g (en infusión seca), utilizando la mezcla HAP método EPA 8310 (cat.# 31874). Las muestras fortificadas se maceraron durante la noche a aproximadamente 4 ºC para optimizar la incorporación de los HAP previo a su extracción. La Tabla I resume el procedimiento final de extracción optimizada.
* Desde la finalización de este artículo, Restek ha desarrollado material de referencia HAP4 certificado por EFSA (cat.# 32469), preparado en 1.000 µg/ml de tolueno, compatible con los solventes QuEChERS.
Limpieza con extracción en fase sólida
Se realizó un intercambio de 2 ml de extracto a hexano mediante evaporación a menos de 1 ml bajo una suave corriente de nitrógeno en bloque calentador a 50 ºC, agregando luego un volumen total de 2 ml de hexano; este proceso se realizó dos veces. El cartucho de sílice se acondicionó con 3 ml de metanol seguido de 3 ml de acetona bajo alto vacío, luego con 3 ml de hexano:cloruro de metileno (1:1, v/v) y 6 ml de hexano a 1 gota por segundo aproximadamente. Se cargó 1 ml de extracto en el cartucho y se eluyó con 5 ml de diversos porcentajes de cloruro de metileno en hexano (0, 15, 25, 50 y 75%). Las muestras eluidas se concentraron a un volumen final de 1 ml en corriente de nitrógeno a 50 ºC. La Tabla I resume el procedimiento final de limpieza.
Tabla 1: Procedimiento final de extracción y limpieza — Extracción QuEChERS modificada
Métodos de cromatografía de gases
Se utilizaron tres formatos de métodos cromatográficos optimizados: GC-FID, GC-TOFMS y GC-MS/MS. GC-FID fue empleado únicamente para las evaluaciones de solventes de extracción. Las plataformas GC-TOFMS y GC-MS/MS se utilizaron para la recuperación de la concentración y el análisis cuantitativo de los HAP.
Cromatografía de gases con detección de ionización de llama (GC-FID)
Se utilizó el método GC-FID (instrumento GCxGC-FID, LECO Corporation) para evaluar los solventes de extracción. Se instaló una columna Rxi®-5Sil MS de 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm (cat.# 13623, Restek Corporation), con flujo constante de helio a 2 ml/min. y programa de horno de 80 ºC durante 0,1 min., aumentando a 8,5 ºC/min. hasta 330 ºC y manteniéndose 0,49 min. La entrada permaneció a 300 ºC con un liner Sky® 4,0 mm ID Precision® (cat.# 23305, Restek Corporation). Se inyectó 1 µl con relación de división 10:1. El detector FID se mantuvo a 350 ºC.
Cromatografía de gases con espectrometría de masas de tiempo de vuelo (GC-TOFMS)
Se utilizó un equipo GC-TOFMS Pegasus III de LECO® para la separación y cuantificación. La cromatografía de gases se realizó con columna Rxi®-PAH de alto contenido de fenilo en configuración de 60 m x 0,25 mm x 0,10 µm (cat.# 49317, Restek Corporation). Se efectuó una inyección sin división de 2,5 µl utilizando un liner Sky® 4 mm con lana y taper individual (cat.# 23303, Restek Corporation). La temperatura de entrada fue de 275 ºC. La válvula de purga splitless se ajustó a 1 min. Se empleó flujo constante de hidrógeno a 2,4 ml/min. con programa de horno de 80 ºC (1 min.), aumentando a 40 ºC/min. hasta 210 ºC, luego a 3 ºC/min. hasta 260 ºC, luego a 11,5 ºC/min. hasta 350 ºC (6,26 min.). El sistema TOFMS Pegasus III operó a 300 ºC de temperatura fuente, ionización de electrones a 70 eV y rango de masa de 45 a 550 u a 5 espectros/seg.
Cromatografía de gases con espectrometría de masas en tándem (GC-MS/MS)
Se utilizó el equipo Thermo TSQ™ 8000 (Thermo Fisher Scientific) para el análisis GC-MS/MS, con columna Rxi®-PAH de 40 m x 0,18 mm x 0,07 µm (cat.# 49316, Restek Corporation), flujo constante de helio a 1,4 ml/min. y liner de entrada de 2 mm con lana y taper individual (cat.# 23316, Restek Corporation). La entrada se mantuvo a 275 ºC y el programa de horno a 80 ºC (1 min.), luego a 37 ºC/min. hasta 210 ºC, luego a 3 ºC/min. hasta 260 ºC, y después a 11 ºC/min. hasta 350 ºC (5 min.). Se utilizó inyección splitless de 0,5 µl con tiempo splitless de 0,58 min. y duración de carga de 0,6 min. La línea de transferencia se mantuvo a 330 ºC. Se recolectaron tres transiciones SRM por compuesto. El modo SRM se empleó para reducir el ruido de fondo aprovechando la fuerte ionización molecular de los HAP; se monitorearon transiciones entre el ión molecular [M]+• en Q1 y los iones [M]+•, [M-H]+• y [M-2H]+• en Q3. La determinación cuantitativa se basó en una transición. La energía de emisión fue de 90 µA y la de colisión se estableció en 10.
Porcentaje de recuperación y determinación de HAP
Se prepararon muestras fortificadas a 500 ng/g mediante el procedimiento optimizado de la Tabla I. Los patrones internos empleados fueron acenafteno-d10, criseno-d12, naftaleno-d8, perileno-d12 y fenantreno-d10, asignados a los analitos según el tiempo de retención más próximo. Para la determinación cuantitativa de muestras fortificadas y no fortificadas se utilizó una curva de calibración de solventes con niveles de 50, 150, 500, 1000 y 2000 ppb.
TABLA 2: Porcentaje de recuperación de HAP fortificados a 50 µg/g en infusión de yerba mate. Comparación de acetonitrilo y hexano:acetona (1:1, v/v) como solventes de extracción.
FIGURA 1: Porcentajes de recuperación de HAP de bajo, medio y alto peso molecular según el porcentaje de cloruro de metileno en hexano empleado en la elución de SPE sobre sílice. Los HAP se fortificaron a 50 µg/g.
Resultados y consideraciones
Investigación sobre el solvente para extracción de muestras
QuEChERS constituye un método ideal para el procesamiento de muestras por ser rápido, fácil y económico. El abordaje inicial comenzó con la hidratación de la infusión seca y su posterior extracción con acetonitrilo, para luego finalizar con el particionamiento mediante el agregado de sales. El paso de hidratación es importante para las extracciones QuEChERS ya que es necesario para obtener el particionamiento correcto [41, 42]. En general, se utiliza acetonitrilo por ser un solvente efectivo para pesticidas con menor co-extracción en algunas matrices [41, 43]. Sin embargo, la solubilidad y recuperación de los HAP con acetonitrilo resultaron problemáticas. Conforme a los resultados, el hexano:acetona (1:1, v/v) es un solvente de extracción más potente para HAP y se lo utilizó en los experimentos restantes.
La Tabla II muestra los valores de recuperación de HAP en muestras de infusión de mate fortificadas a 50 µg/g, procesadas con acetonitrilo y hexano:acetona. La tendencia general muestra menor recuperación de HAP con acetonitrilo, lo que se explica por la inconsistencia de polaridad entre los HAP (compuestos no polares) y el acetonitrilo (solvente polar). Los valores con acetonitrilo también mostraron una recuperación progresivamente menor para los HAP de mayor peso molecular, atribuible a su menor solubilidad. Los valores de recuperación con hexano:acetona (1:1, v/v) se encuentran en el rango aceptable sin sesgo para los HAP de alto peso molecular. En todos los experimentos posteriores se utilizó hexano:acetona (1:1, v/v).
Evaluación del porcentaje de cloruro de metileno en hexano para la limpieza de muestras
Las infusiones y especias pueden presentar un gran desafío por ser matrices muy complejas. La limpieza de muestras es necesaria para eliminar el material de co-extracción y prepararlas para el análisis. Las técnicas integrales de limpieza pueden reducir significativamente los compuestos de co-extracción [44, 45], aunque a menudo demandan mucho tiempo y esfuerzo.
La estrategia adoptada fue desarrollar un procedimiento de limpieza simple que elimine suficiente material de co-extracción para un análisis exitoso, minimizando los recursos necesarios. Los sistemas de cromatografía de gases pueden dañarse rápidamente si se introducen muestras con gran cantidad de material no volátil, que se deposita en la entrada, ensucia el liner y la cabeza de la columna, y requiere mantenimiento frecuente.
La limpieza en SPE sobre sílice fue optimizada en relación con el solvente de elución y el volumen. Los HAP pueden eluirse con una combinación de hexano y cloruro de metileno. Se evaluaron muestras de infusión fortificadas a 50 µg/g con diversos solventes de elución. La Figura 1 muestra el porcentaje de recuperación según el porcentaje de cloruro de metileno en hexano para HAP de bajo, medio y alto peso molecular. El acenafteno (bajo peso molecular) se eluyó fácilmente con hexano, pero los compuestos de mayor peso molecular requirieron un solvente más potente. Con 15% de cloruro de metileno en hexano, los HAP de tamaño medio como los del grupo HAP4 logran una recuperación cercana al 100%; sin embargo, el coroneno solo alcanza aproximadamente el 60%. Se decidió utilizar 30% de cloruro de metileno en hexano, composición que arrojó una recuperación aceptable para todos los HAP objetivo. Una mayor proporción mejoraría la recuperación de los HAP más grandes, pero también aumentaría el material de co-extracción.
Optimizar la separación cromatográfica es fundamental para el análisis de los HAP debido a los compuestos isobáricos que coeluyen y dificultan la determinación cuantitativa. Se desarrolló un método optimizado utilizando una columna Rxi®-PAH de alto contenido de fenilos, selectiva para los HAP altamente aromáticos. Gracias a la selectividad de la fase estacionaria, el análisis de los 30 HAP del estudio, incluidos los dibenzopirenos, se completó en 35 minutos.
La Figura 2A muestra un cromatograma de iones extraídos de m/z 226 y 228 para la infusión comercial 1, obtenido con el método GC-TOFMS. La separación de trifenileno y criseno arroja picos distintivos, lo que permitió una confiable integración de ambos compuestos isobáricos. De modo similar, el benzo[b]fluoranteno, el benzo[j]fluoranteno y el benzo[k]fluoranteno, difíciles de separar, pudieron resolverse correctamente como ilustra la Figura 2B.
En total, el método optimizado logró separar los pares críticos y permitió una determinación cuantitativa precisa e independiente de los principales marcadores de toxicidad, incluidos el criseno y el benzo[b]fluoranteno (HAP4 de EFSA) y el dibenz[a,h]antraceno (HAP8).
FIGURA 2A: Cromatograma de iones extraídos por GC-TOFMS de m/z 226 y 228, que muestra la separación de trifenileno y criseno detectados en la infusión comercial 1.
FIGURA 2B: Cromatograma de iones extraídos por GC-TOFMS de m/z 252, que muestra la separación de benzofluorantenos detectados en la infusión comercial 1.
HAP detectados en las infusiones
El análisis cuantitativo se completó mediante el método cromatográfico optimizado. Se evaluaron los valores detectados de los compuestos isobáricos en seis infusiones de mate comerciales, cuyos resultados se describen en la Tabla III. Se demuestra el sesgo cuantitativo al comparar las concentraciones en cada par isobárico (agrupados entre filas en gris).
De acuerdo con los valores de la Tabla III, el criseno presentaría un sesgo de aproximadamente 20%, el benzo[b]fluoranteno de aproximadamente 50% y el dibenzo[a,h]antraceno de aproximadamente 60% si se informara el área combinada de los pares. La capacidad de separar estos compuestos resulta crítica para determinar la presencia y concentración de los HAP marcadores de toxicidad.
Tabla III: Valores de HAP detectados en seis infusiones de mate, determinados mediante el método de extracción/limpieza final y análisis GC-TOFMS. Los pares isobáricos se agrupan en filas de color gris.
Recuperación de HAP en infusiones fortificadas
Para el método optimizado se empleó la extracción QuEChERS modificada con hexano:acetona (1:1, v/v), limpieza SPE sobre sílice, y columna de GC Rxi®-PAH selectiva. Tanto GC-MS/MS como GC-TOFMS arrojaron valores de recuperación satisfactorios, aunque GC-MS/MS mostró mejor sensibilidad. Los valores de recuperación se describen en la Tabla IV.
Los valores de recuperación de todos los HAP del estudio varían de 72% a 130%, con solo cuatro compuestos entre el 70% y 80%. La recuperación de los compuestos PAH4 de EFSA fue del 81-100% y la de los compuestos PAH8 de EFSA se estableció entre el 81% y 110%. Estos valores indican que el método es apropiado para HAP con un amplio rango de volatilidad y peso molecular.
Tabla IV: Porcentaje de recuperación de HAP en una infusión comercial. Los HAP se fortificaron a 500 µg/g de infusión seca.
Comparación de GC-TOFMS y GC-MS/MS para compuestos PAH4 de EFSA
Se procesaron muestras de seis infusiones de yerba mate con el método optimizado y dos métodos basados en GC-MS. El método GC-TOFMS utilizó una columna Rxi®-PAH de 60 m x 0,25 mm x 0,10 µm (cat.# 49317), que mejora la separación de los compuestos isobáricos y la capacidad de carga de muestras. La resolución de picos se mejoró usando hidrógeno como gas transportador; los HAP forman fuertes iones moleculares y no presentan reactividad con el hidrógeno, por lo que no se pierde sensibilidad.
El método GC-MS/MS empleó la columna Rxi®-PAH en formato de 40 m x 0,18 mm x 0,07 µm (cat.# 49316), que equilibra separación y tiempo de análisis. La menor carga de muestras derivada del reducido espesor de lámina de la fase estacionaria hizo importante reducir el volumen de inyección. Las muestras de yerba mate presentaron concentraciones de HAP relativamente elevadas, por lo que la inyección de 0,5 µl no afectó la detectabilidad total; sin embargo, para otros productos con niveles de trazas de HAP, la elevada sensibilidad de la MS en tándem puede compensar los bajos volúmenes de inyección.
Las concentraciones de los compuestos PAH4 detectados por GC-TOFMS y GC-MS/MS se presentan en la Tabla V. Los niveles combinados de PAH4 figuran en la última fila. Los valores determinados por ambas técnicas coinciden, indicando que tanto la preparación de muestras como los métodos de análisis son apropiados para el análisis de HAP en infusiones de yerba mate.
Tabla V: Concentraciones detectadas (ng/g de infusión seca) de los compuestos PAH4 en seis marcas de yerba mate. Por cada infusión se indican los valores de GC-MS/MS y GC-TOFMS. Las concentraciones combinadas de PAH4 se detallan en la última fila.
Conclusión
Las infusiones de mate evaluadas presentan altos niveles de HAP en comparación con el límite residual promedio de 1 a 10 ng/g. La combinación de PAH4 de EFSA varía de 190 a 800 ng/g en infusión seca (Tabla V). El método optimizado de preparación de muestras arrojó una recuperación satisfactoria de todos los HAP evaluados. Los métodos cromatográficos selectivos se complementaron con la detección basada en MS.
Se alcanzó una separación suficiente de HAP isobáricos mediante columnas Rxi®-PAH con fase estacionaria selectiva, lo que permite la determinación cuantitativa directa de los HAP individuales. En términos generales, este método demandó menos recursos y tiempo que los habitualmente requeridos para el análisis de una matriz compleja como la infusión de yerba mate, con una mejor calidad de los datos.
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