05 Sep El impacto de la composición del solvente y el volumen de inyección en el rendimiento cromatográfico
Luna C18(2) Phenomenex: inyección y rendimiento en HPLC
Basado en la nota técnica desarrollada para Phenomenex por:
Dr. Helen Whitby. Phenomenex LTD, Queens Avenue, Hurdsfield Industrial Estate, Macclesfield, Cheshire, SK10 BN, United Kingdom
Dr. Marc Jacob. Phenomenex, Inc., 411 Madrid Ave., Torrance, CA 90501 USA
Introducción
Hoy en día, los laboratorios modernos están bajo presión para mejorar el rendimiento a través de la alta resolución y reproducibilidad en el análisis cromatográfico. Sin embargo, debido al aumento del rendimiento, en las separaciones a menudo se sacrifican estos objetivos en aras de los tiempos de análisis más rápidos. En esta nota técnica se estudian los efectos de la concentración del solvente y los volúmenes de inyección sobre el rendimiento cromatográfico de columnas de fase reversa C18 de sílice porosa, en condiciones de gradiente. Se exploran los problemas cromatográficos que se presentan en estas condiciones y las posibles soluciones.1
La extracción en fase sólida (SPE) ha sido ampliamente adoptada para obtener extractos más limpios a partir de matrices complejas, como por ejemplo el suero. Sin embargo, el inconveniente de tal técnica es que la extracción se basa en el uso de altos niveles de solvente orgánico, dejando al cromatografista frente a la necesidad de someter a la muestra al proceso de secado y la reconstitución de la misma en un solvente de inyección más apropiado para el método subsiguiente de HPLC.
Si los analitos son inyectados directamente en la columna de HPLC en los solventes típicos de los métodos de SPE, se observa distorsión de picos y desdoblamiento de los mismos. Varios autores han notado desdoblamiento de picos y distorsión cuando el solvente de inyección es distinto a la fase móvil, y el origen de la distorsión y del desdoblamiento ha sido objeto de discusión. Muchas publicaciones mencionan la fuerza del solvente2-5 como la razón de la forma de los picos observada, y otros apuntan a la viscosidad del solvente.6 Se observó también que estos efectos fueron amplificados por el uso de columnas más pequeñas en modo gradiente.
Los cromatografistas dedicados a la cromatografía preparativa también enfrentan los problemas debidos a la falta de coincidencia entre la fase móvil y el solvente de inyección. Gran parte de esto se deriva del uso de los solventes fuertes requeridos en la cromatografía preparativa para solubilizar muestras altamente concentradas, y el DMSO es comúnmente utilizado. La dilución en la columna puede utilizarse para aliviar algunos de los efectos observados cuando no es posible emplear disolventes más débiles ni volúmenes de inyección más pequeños.
Condiciones experimentales
Sistema
Sistema de HPLC con desgasador en línea, muestreador automático, horno termostatizador de columna ajustado a 30 °C, bomba binaria y detector de arreglo de diodos con celda de paso óptico de 6 mm. La absorbancia fue monitoreada a 254 nm. El efecto del volumen muerto fue minimizado por el uso de tuberías de conexión de 0,007 pulgadas de diámetro interno. Los datos fueron adquiridos a través de un software de adquisición y análisis de datos.
Materiales
- Acetonitrilo grado HPLC
- Agua grado HPLC
- Tiourea
- Cafeína
- Fenol
- Acetofenona
- Dimetilftalato
- Valerofenona
- Ácido fórmico
Preparación de muestras
La meta del estudio fue examinar el efecto de la composición del solvente de inyección y el volumen de inyección en el desempeño cromatográfico, por lo tanto fue importante eliminar el efecto de carga de la columna. Una solución de referencia de tiourea (32 mg/mL), cafeína (40 mg/mL), fenol (16 µL/mL), acetofenona (24 µL/mL), dimetilftalato (64 µL/mL) y valerofenona (32 µL/mL) fue preparada en acetonitrilo a seis concentraciones diferentes (25 %, 33 %, 50 %, 66 %, 75 %, 100 %). Usando cada una de estas 6 muestras, se realizaron diluciones seriadas para acomodar volúmenes de inyección entre 1 y 100 µL, para mantener una carga de columna equivalente. Se realizaron tres inyecciones para cada volumen y dilución y el promedio fue utilizado para el análisis de datos.
Condiciones de corrida de HPLC
Se utilizaron cuatro columnas para HPLC Luna C18(2) de 3 µm de tamaño de partícula: 50 × 2,0 mm, 30 × 2,0 mm, 20 × 2,0 mm y 20 × 4,0 mm.
Fase móvil: A: 0,1 % ácido fórmico en agua. B: 0,1 % ácido fórmico en acetonitrilo.
Gradiente: A/B (95:5) a A/B (5:95) en 3 minutos para las columnas de 20 mm de largo, en 4,5 minutos para las columnas de 30 mm de largo y en 7,5 minutos para las columnas de 50 mm de largo.
Flujo: 1 mL/min para las columnas de 2,0 mm de diámetro interno y 4 mL/min para las columnas de 4,0 mm de diámetro interno, para mantener una velocidad lineal de 0,3 cm/s.
Detector: DAD a 254 nm.
Resultados y discusión
El trabajo demostró el efecto de la fuerza del solvente y el volumen de muestra inyectada en el rendimiento cromatográfico. En un solvente moderado (33 % acetonitrilo) la cafeína es eluida con un pico simétrico (A); a medida que la fuerza del solvente aumenta de 66 % (B) a 100 % (C) se observa una distorsión gradual, como se observa en la Figura 1.
Figura 1: Columna Luna C18(2) 3 µm 50 × 2,0 mm, volumen de inyección 4 µL.
Para determinar si la naturaleza de la distorsión era debida a la fuerza del solvente o a la viscosidad del mismo, se añadió un líquido de alta viscosidad (PEG 600) a la muestra B (66 % acetonitrilo) para contrarrestar el descenso de la viscosidad debida al aumento de acetonitrilo. No se evidenciaron mejoras en la forma del pico, lo que sugiere que la distorsión es un resultado directo del incremento de la fuerza del solvente y no se debe a un cambio en la viscosidad del mismo.
Estos datos se muestran en la Figura 2 y evidencian que hay poca diferencia entre las líneas B y C del cromatograma, ambas corridas usando 66 % de acetonitrilo, comparadas con la línea A corrida en agua al 100 %. Si el efecto observado en la Figura 1 hubiera sido el resultado de cambios en la viscosidad, se habrían visto diferencias en los resultados para las líneas B y C debido a la adición de PEG 600, y esto no se evidenció.
Figura 2. Columna Luna C18(2) 3 µm 30 × 2,0 mm, volumen de inyección 20 µL.
- Muestra disuelta en agua
- Muestra diluida en 66 % acetonitrilo
- Muestra diluida en agua:acetonitrilo:PEG 600 (1:2:2)
El volumen de inyección puede también tener efecto marcado en la forma del pico (Figura 3). Cuando se inyectó 1 µL de cafeína en acetonitrilo al 100 % no hubo efecto marcado en la simetría del pico; sin embargo, a medida que se incrementó el volumen de inyección, la forma del pico se fue distorsionando gradualmente.
Figura 3. Columna Luna C18(2) 3 µm 50 × 2,0 mm. Cafeína 7,5 mg/mL en acetonitrilo 100 %.
El ensanchamiento del pico a medida que se sobrecarga la columna con mayores volúmenes de inyección se observa en mayor medida cuando se utiliza un solvente fuerte, lo que resulta en una rotura del equilibrio de la distribución entre el analito y la fase estacionaria. El efecto es mayor para los primeros picos de elución. Los picos tardíos soportan mejor volúmenes de inyección mayores antes de mostrar distorsión de picos (Figura 4).
Figura 4. Columna Luna C18(2) 3 µm 50 × 2,0 mm, solvente de inyección 100 % acetonitrilo.
A través del uso de gráficos tridimensionales (no mostrados en este trabajo) quedaron claras varias tendencias. Los analitos que eluyen más tarde pueden soportar mejor volúmenes de inyección mayores que los picos de elución temprana en la misma composición. Una rápida disminución de la eficiencia se observa cuando se incrementa el volumen de inyección usando un solvente fuerte (100 % acetonitrilo). Esta situación mejora a medida que el solvente es más débil, y la eficiencia de la columna se mantiene en un rango mayor de volúmenes de inyección.
En resumen, el analista puede mantener la forma de pico usando un solvente menos fuerte o ajustando el gradiente para que el analito tenga un valor de factor de retención (k) mayor.
Para la cromatografía preparativa los desafíos son diferentes. Las altas concentraciones de muestra y los volúmenes mayores de inyección son necesarios, resultando en el uso de solventes orgánicos fuertes como el DMSO. Las recomendaciones para separaciones preparativas son muy similares a las de las aplicaciones analíticas y, cuando sea posible, deben coincidir con las condiciones iniciales del método; sin embargo, en la realidad esto no siempre es posible y los cromatografistas dedicados a la cromatografía preparativa pueden verse en la necesidad de usar dilución en la columna7 para aliviar algunos de los efectos de las restricciones del solvente de inyección.
Conclusiones
La composición del solvente es crítica en el éxito del método cromatográfico. El rendimiento cromatográfico puede verse comprometido si la fuerza del solvente es muy alta o si el volumen de inyección es muy grande. La fuerza del solvente parece explicar la pérdida de rendimiento más bien que la viscosidad de la muestra, y es el resultado de una compleja interacción entre la fuerza del solvente, el volumen de inyección y el factor de retención del analito (k).
Cuando la dilución de la muestra no es posible, se pueden ajustar otros parámetros para mejorar el rendimiento del método:
- Ajustar el gradiente para incrementar la retención del analito de interés (k), ya que los picos que eluyen más tarde se ven menos afectados por la inyección en solventes fuertes.
- Usar una columna más larga para aumentar el tiempo de retención.
- Cambiar a una columna de un diámetro interno mayor para poder inyectar mayor cantidad de muestra y ajustar el gradiente para mantener la separación.
En la cromatografía preparativa, donde no es posible equiparar la composición del solvente a la de la fase móvil debido a problemas de solubilidad, el cromatografista puede querer utilizar dilución en la columna para reducir este efecto.7 En el método de dilución en la columna, el solvente orgánico es suministrado a la columna en la misma trayectoria en que el inyector introduce la muestra. Esta corriente se combina con la solución acuosa inmediatamente antes de la columna, lo que reduce la distorsión de pico cuando se usan solventes tales como DMSO.
Alternativamente, una precolumna instalada en la cabecera de la columna, rellena de partículas de sílice de 20–60 µm, también puede usarse para reducir el efecto de los solventes de inyección fuertes, a medida que se introduce la muestra en la precolumna del sistema preparativo.8 En efecto, la precolumna actúa como una cámara de mezcla entre la inyección de la muestra y la fase móvil antes de alcanzar la columna de HPLC.
Referencias
- Layne J. et al, J. Chromatography A, 913 (2001) 233-242.
- Vukmanic D., Chiba M., J. Chromatography 483 (1989) 189.
- Hoffman N., Rahman A., J. Chromatography 473 (1989) 260.
- Hoffman N., Pan S., Rustum A., J. Chromatography 465 (1989) 189.
- Hoffman N., Chang J., J. Liq. Chromatography 14 (1991) 561.
- Czok M., Katti A., Guiochon G., J. Chromatography 550 (1991) 705.
- Neue U.D., Mazza C.B., Cavanaugh J.Y. et al. Chromatographia (2003) 57 (Suppl. 1): S121.
- Miller L., PREP Symposium, Boston, julio de 2012.
Más información: www.cosmobio.com.ar