14 Sep Biolog con espectrofotometría de masas MALDI-TOF y secuenciación genética de ARN ribosómico
Identificación bacterias: Biolog GEN III vs MALDI-TOF 16S
Autores: P. Wragg; L. Randall; A.M. Whatmore
Comparación del sistema semi-automatizado de Biolog con espectrometría de masas MALDI-TOF y secuenciación genética de ARN ribosómico 16S para la identificación de bacterias de interés en veterinaria
Reseña
Los recientes avances en los métodos fenotípicos y quimiotaxonómicos han mejorado la capacidad de los sistemas para identificar bacterias a nivel de especie. La clave para el uso efectivo de estos sistemas reside en la posibilidad de recurrir a bases de datos que pueden ampliarse con nueva información sobre aislamientos atípicos o noveles. En el presente estudio, comparamos el rendimiento del sistema de identificación Biolog GEN III (de aquí en adelante, GEN III) con la espectrometría de masas mediante MALDI-TOF (desorción/ionización por láser asistida por matriz—tiempo de vuelo) y la secuenciación del gen ARNr 16S para la identificación de aislamientos de interés en veterinaria. A fin de evaluar la capacidad de los sistemas en su mayor rango de rendimiento, se emplearon las cepas más difíciles de identificar con los métodos de rutina. Durante un período de 18 meses, se analizaron 100 cepas mediante los tres métodos. Para destacar la importancia de la identificación a nivel de especie, se diseñó un sistema de puntaje ponderado capaz de diferenciar la capacidad de identificación a nivel de género y a nivel de especie. Al comparar con el estándar de referencia, el puntaje ponderado total relativo fue 0,869:0,781:0,769, mediante secuenciación del gen ARNr 16S, sistema GEN III y espectrometría de masas MALDI-TOF, respectivamente. El rendimiento a nivel de género resultó significativamente mejor utilizando la secuenciación del gen ARNr 16S. Sin embargo, el rendimiento a nivel de especie fue similar para los tres sistemas.
Introducción
Gracias al perfeccionamiento tecnológico observado en las últimas décadas, los laboratorios de microbiología que procesan especímenes clínicos de rutina han adoptado técnicas metabólicas automatizadas o semi-automatizadas. Sin embargo, la variación intra especies y el frecuente reconocimiento de nuevas especies comenzaron a socavar la precisión de sistemas fenotípicos menos sofisticados [1]…
[Contenido restante: Introducción completa con todas las referencias a métodos y antecedentes]
Materiales y métodos
Selección y caracterización inicial de aislamientos
La mayoría de los aislamientos empleados en este estudio (n = 100) consistieron en cepas de campo derivadas de especímenes clínicos enviados al Laboratorio de Bacteriología Determinativa de AHVLA (AHVLA, Bury St Edmuns, Reino Unido), si bien también se incorporaron algunas cepas de la Colección Nacional de Cultivos Tipo (NCTC, Colindale, Londres). Los aislamientos se cultivaron en agar Columbia (Oxoid, Basingstoke, Reino Unido) complementados con un 5% de sangre de cordero e incubados de acuerdo con los requerimientos de crecimiento, ya sea de modo aeróbico o en un entorno enriquecido con dióxido de carbono (7,5% CO₂), a 37 °C durante 18 a 24 horas.
Biolog MicroStation con sistema de microplacas GEN III
[Contenido del método Biolog]
Identificación mediante la secuenciación del gen ARNr 16S
[Contenido del método secuenciación]
Espectrometría de masas mediante desorción/ionización por láser asistida por matriz—tiempo de vuelo (MALDI-TOF)
[Contenido del método MALDI-TOF]
Resultados
Puntuación del resultado según su resolución a género o especie
La Tabla 1 muestra un resumen de los resultados. A fin de reflejar el valor de la identificación a nivel de especie para el laboratorio diagnóstico, se diseñó un sistema de puntaje ponderado basado en la comparación con el gold standard representado por la secuenciación del gen ARNr 16S, y denominado “identificación presuntiva” en la Tabla 1…
Sistema de identificación Biolog GEN III
El software GEN III ofreció indicaciones claras acerca del grado de falta de certeza para la identificación a nivel de género y especie…
Espectrometría de masas MALDI-TOF
El número de cepas que no pudieron identificarse, al menos a nivel de género, fue menor que con GEN III (n = 12)…
Secuenciación de ARNr 16S
Solo una cepa no pudo ser identificada con la secuenciación de ARNr 16S (cepa 10418 de NCTC, Escherichia coli)…
Análisis estadístico
Se comparó el rendimiento total de los tres sistemas en relación con dos medidas binarias…
Discusión
Los estudios comparativos acerca del rendimiento de los sistemas de identificación deberían considerar la importancia de la identificación a nivel de especie y la relevancia de la identificación errónea. A nivel clínico o epidemiológico, los datos erróneos o limitados podrían resultar en regímenes de tratamiento inadecuados o en un análisis estadístico de prevalencia engañoso…
[Contenido completo de discusión, incluyendo todas las comparaciones y análisis]
Conclusión
Las relativas fortalezas y debilidades demostradas en los tres sistemas destacan el aporte realizado por el bacteriólogo especializado en dos áreas clave: en primer lugar, la capacidad de seleccionar la técnica más adecuada para el aislado desconocido, basándose en el conocimiento previo de las características fundamentales del organismo (por ejemplo, historial de casos, sitio de aislamiento, y rasgos primarios como morfología general y microscópica) y, en segundo lugar, la capacidad de efectuar una referencia cruzada entre el resultado del sistema y las características fundamentales mencionadas…
Agradecimientos
Parte de esta investigación se presentó en el Segundo Congreso de la European Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians (EAVLD), Kazimierz Dolny, 1–4 de julio, 2012.
Agradecemos a Therese Carson, AHVLA Bury St Edmunds y la unidad de aseguramiento de calidad de AHVLA VetQas (VetQas, Sutton Bonington, Reino Unido) por proporcionar muchas de las cepas de investigación utilizadas en este estudio, y a Robin Sayers, Specialist Scientific Support Department, AHVLA Weybridge, por el análisis estadístico de los datos. La financiación para este trabajo se obtuvo del Research and Development Internal Investment Fund de AHVLA, proyectos RD0038, RD0016 y TDP061.