Orbitrap Exploris 120: nitrosaminas en fármacos por LC-MS

Beneficios de la aplicación

• Detección y cuantificación de nueve nitrosaminas con un solo método de espectrometría de masas de alta resolución acoplado a cromatógrafo líquido de alta presión.
• Cuantificación de impurezas de nitrosamina en el principio activo ranitidina por debajo del nivel de ingesta diaria aceptable, en cumplimiento con las pautas regulatorias de la FDA.
• Uso del Software Chromeleon™ (CDS) Thermo Scientific™ para recopilación y procesamiento de datos en un entorno totalmente compatible con 21 CFR 11, ideal para instalaciones cGMP.

Objetivo

Demostrar una cuantificación rápida y altamente sensible de nueve nitrosaminas con un espectrómetro de masas Thermo Scientific™ Orbitrap Exploris™ 120, y mostrar el uso del método LC-MS para medir las impurezas de nitrosamina en productos farmacéuticos de ranitidina (Materia Prima y Producto Terminado) disponibles comercialmente.

¿Qué son las nitrosaminas?

Las nitrosaminas son sustancias químicas de pequeño peso molecular que probablemente son carcinógenos humanos, y los reguladores consideran inaceptable su presencia en medicamentos. Desde 2018, la FDA de los Estados Unidos ha anunciado una serie de retiradas voluntarias de productos farmacéuticos tras la detección de impurezas de nitrosamina genotóxicas. Las agencias reguladoras internacionales han establecido límites aceptables de ingesta diaria de nitrosaminas.^1,2

Dados estos límites de acción bajos, los fabricantes de productos farmacéuticos y las organizaciones de pruebas por contrato están desarrollando métodos para cuantificar las nitrosaminas en excipientes, principios farmacéuticos activos (PFA) y productos farmacéuticos, para garantizar que los lotes no superen los niveles de aceptación reglamentaria.

La detección y cuantificación confiables de nitrosaminas en productos farmacéuticos son un desafío debido a la presencia de una matriz de formulación compleja y el nivel de trazas de estas impurezas en relación con la alta concentración de PFA. La espectrometría de masas basada en Orbitrap es capaz de determinar selectivamente analitos a concentraciones bajas con alta confianza, incluso en presencia de ruido de fondo elevado.

Varios métodos validados de la FDA de EE. UU. han demostrado alta selectividad, sensibilidad y cuantificación de impurezas de nitrosamina en diversos productos farmacéuticos.^3,4,5 La FDA publicó recientemente una guía que exige la evaluación de riesgos e implementación de estrategias de control para limitar la formación de estas impurezas en todas las drogas humanas.⁶ Las nuevas pautas también sugieren expandir los controles a siete impurezas y establecen que el contenido total de nitrosamina no puede exceder 30 ppb (26,5 ng/día) si se detecta más de una nitrosamina.

En esta nota se describe un método de LC-MS desarrollado y validado, utilizando un sistema Vanquish Horizon UHPLC Thermo Scientific™ acoplado a un espectrómetro de masas Orbitrap Exploris 120, para detectar y cuantificar nueve nitrosaminas en una sola corrida analítica. El método se realiza mediante ionización química a presión atmosférica (APCI) y puede cuantificar las impurezas por debajo del límite recomendado, tanto en solución pura como en excipientes. La adquisición y el procesamiento de datos se llevaron a cabo en el software Chromeleon CDS, listo para cumplir con los requisitos regulatorios de 21 CFR Parte 11 (FDA EE. UU.) y el Anexo 11 (UE).

Por último, este método se aplicó para detectar y cuantificar nitrosaminas en productos farmacéuticos con ranitidina de venta libre disponibles comercialmente, y también es aplicable para la determinación de nitrosaminas en otros medicamentos.

Experimental

Reactivos e insumos

• Agua, grado UHPLC-MS, Thermo Scientific (P/N W81)
• Metanol (MeOH), grado UHPLC-MS, Thermo Scientific (P/N A4581)
• Ácido fórmico, Fisher Chemical™ Optima™ Disolvente LC/MS (P/N A117-10X1AMP)
• Clorhidrato de ranitidina, Sigma-Aldrich (R101-5G)
• Patrones de referencia de nitrosamina (ver Tabla 1)
• N,N-dimetilformamida (DMF), grado HPLC, Sigma-Aldrich (P/N 270547)
• Tableta de 300 mg de ranitidina de venta libre

Preparación de la muestra

Preparación de la formulación del excipiente: Se preparó una matriz de formulación para imitar el ingrediente de formulación de fármaco ranitidina, mezclando 750 mg de celulosa microcristalina, 30 mg de croscarmelosa de sodio, 30 mg de estearato de magnesio, 2000 mg de hipromelosa E15 y 1000 mg de lactosa.

Estándares puros y excipientes: Se prepararon patrones puros combinados que variaban de 10 a 5000 ng/mL diluyendo las soluciones madre de 1 mg/mL con metanol puro. Se preparó una solución de trabajo de patrones internos combinados a 500 ng/mL. Se prepararon estándares puros que variaban de 0,1 a 50 ng/mL mezclando 10 µL de estándares de trabajo con 10 µL de estándares internos de trabajo, seguido de la adición de 980 µL de metanol puro.

Se prepararon estándares de excipiente que variaban de 0,1 a 50 ng/mL mezclando 10 µL de solución de trabajo de estándares combinados y 10 µL de estándares internos con 30 mg de mezcla de excipientes, dejándola secar a temperatura ambiente durante 30 min y resolubilizándola con 1 mL de metanol. La mezcla se agitó durante 40 min con agitador mecánico, seguido de centrifugación durante 15 min a 4000 RPM. Se decantaron 750 µL de sobrenadante y se filtraron con filtro de jeringa de PVDF de 0,2 µm.

Se preparó un estándar de referencia de DMF de 1 ppm realizando una dilución 1:1.000.000 de DMF de calidad HPLC con metanol puro. Se inyectaron 5 µL del estándar de referencia para verificar la presencia de DMF en la sustancia farmacéutica y el producto de ranitidina comparando el tiempo de retención y los iones isotópicos controlados.

Preparación de sustancias y fármacos de ranitidina: La extracción de la sustancia ranitidina se llevó a cabo resolubilizando 30 mg de clorhidrato de ranitidina con 1 mL de metanol para obtener una concentración final de 30 mg/mL. Se añadieron 10 µL de estándar interno de 500 ng/mL para dar una concentración final de 5 ng/mL.

Se prepararon 300 mg de extracto de tableta de ranitidina mezclando 10 mL de metanol con tableta molida. Se agregaron 100 µL de estándar interno de 500 ng/mL para dar una concentración final de 5 ng/mL. La mezcla se agitó durante 40 min en agitador mecánico, seguido de centrifugación durante 15 min a 4000 RPM. Se decantaron 750 µL de sobrenadante y se filtraron con filtro de jeringa de PVDF de 0,2 µm.

Evaluación de la reproducibilidad de la recuperación y extracción de la muestra: Para la evaluación de la recuperación, las muestras de excipiente extraídas se prepararon agregando estándares puros a niveles de 2 ng/mL y 5 ng/mL en el excipiente en blanco antes del proceso de extracción. Para las muestras enriquecidas, se añadieron los mismos estándares al excipiente en blanco después del proceso de extracción. La relación de área de pico (estándar sobre estándar interno) del excipiente extraído se comparó con la del excipiente enriquecido para el cálculo del % de recuperación.

Método LC-MS

Se desarrolló un único método LC-MS dirigido utilizando un sistema Vanquish Horizon UHPLC acoplado a un espectrómetro de masas Orbitrap Exploris 120. Se inyectaron 5 µL de muestras en una columna Acclaim Polar Advantage II, usando el gradiente de la bomba y las condiciones descritas en la Tabla 2. Todas las nitrosaminas se analizaron usando una sonda APCI con parámetros de fuente optimizados y configuraciones de exploración descritos en las Tablas 3 y 4.

El software Chromeleon 7.2.10 CDS se utilizó tanto para la adquisición como para el análisis de datos, cumpliendo con los requisitos reglamentarios del 21 CFR Parte 11 de la FDA de EE. UU. y el Anexo 11 de la Comisión Europea.

Resultados y discusión

Determinación selectiva de impurezas de nitrosamina. El método se utilizó en la monitorización selectiva de iones dirigida (tSIM) y la MS en tándem dirigida (tMS2) con una velocidad de escaneo rápida (3 Hz, con una resolución de 120.000) para una sensibilidad y selectividad óptimas de las nitrosaminas objetivo (Tabla 5).

La Figura 1 muestra una comparación del cromatograma de iones extraído (XIC) de cada impureza de nitrosamina en el excipiente en blanco con un estándar de control de 0,5 ng/mL en un ajuste de tolerancia de masa de 3 ppm. Aparte del NDBA, no se observaron otras interferencias endógenas en el extracto de excipiente usado como blanco. Aunque el método no pudo resolver a línea de base el interferente de NDBA con las condiciones actuales de gradiente, la cantidad de interferente fue <20% a 0,1 ng/mL (el calibrador más bajo) e insignificante a 0,5 ng/mL.

Figura 1. XIC de cuantificación de iones de impurezas de nitrosamina en a) excipiente en blanco y b) estándar de control de 0,5 ng/mL con un ajuste de tolerancia de masa de 3 ppm.

Condición de EM optimizada para las nitrosaminas objetivo:

Extracción y recuperación de muestras para el análisis de nitrosaminas. La recuperación de la muestra y la reproducibilidad del proceso de extracción se evaluaron agregando estándares puros de nitrosamina a niveles de 2 y 5 ng/mL en la matriz del excipiente en blanco antes y después del proceso de extracción. La Tabla 6 muestra los valores típicos de recuperación y reproducibilidad con cinco inyecciones repetidas. La recuperación de todas las nitrosaminas durante el proceso de extracción fue entre 95 y 105%, y la reproducibilidad de las inyecciones replicadas estuvo dentro del 10% RSD.

Alcanzando los límites de rendimiento reglamentarios. Con los nuevos límites recomendados por la FDA (menos de 30 ppb para un total de 7 nitrosaminas⁶), las rápidas velocidades de escaneo del Orbitrap Exploris 120 permitieron detectar y cuantificar todas las nitrosaminas objetivo a 17 ppb (0,5 ng/mL), incluso con la configuración de resolución más alta. La Tabla 7 muestra la exactitud y precisión típicas del estándar de control de 17 ppb en el excipiente. Las curvas de calibración se construyeron trazando las proporciones del área de los picos del estándar sobre el estándar interno frente a las concentraciones del estándar, con una ponderación de 1/x. La Figura 2 muestra la curva de calibración para todos los compuestos y la Tabla 8 los LOD, LLOQ y valores de linealidad para todas las nitrosaminas en el excipiente. El coeficiente de regresión lineal (R²) para todas las curvas fue superior a 0,99, y los LOD y LLOQ resultantes fueron casi idénticos entre las dos matrices, lo que sugiere que el método es resistente a efectos de matriz para la formulación probada.

Niveles de impurezas de nitrosamina en el producto farmacéutico ranitidina. Las nitrosaminas se cuantificaron en fármacos y comprimidos de ranitidina disponibles comercialmente. La cantidad medida de NDMA en la sustancia farmacéutica de ranitidina 30 mg/mL excedió el límite superior de calibración y se estimó en más de 7 ppm (Figura 3a), mientras que la cantidad medida de NDMA en una tableta de ranitidina de 300 mg fue 82 ppb (Figura 3b); ambos valores excedieron el límite regulatorio aceptable.

En ambos casos, los datos se procesaron con un ajuste de tolerancia de masa de 3 ppm. La cuantificación no se vio afectada cuando se redujo el ajuste a 1 ppm. Sin embargo, un ajuste de tolerancia de masa >20 ppm (tolerancia típica en espectrómetros de tiempo de vuelo) resultaría en una sobreestimación significativa de las concentraciones de NDMA por la coelución con DMF. El espectro de masas de NDMA en el ápice contenía dos iones interferentes (m/z 75.05707 y 75.06340), coincidiendo con el isotopo ¹⁵N (75.05700) y ¹³C (75.06340) de DMF, con precisión de masa de sub-ppm. La presencia de DMF se confirmó controlando la masa monoisotópica del ion molecular (m/z 74.0600). Se requiere un ajuste de resolución mínimo de 45.000 y una tolerancia de masa máxima de 15 ppm para evitar la sobreestimación de NDMA. Como ilustración hipotética (Figura 4b), la NDMA determinada fue un 13% más alta cuando se procesó la cuantificación con un ajuste de tolerancia de masa de 25 ppm, en lugar de 3 ppm (Figura 3b). Este hallazgo es consistente con un artículo de la FDA publicado recientemente en The AAPS Journal, que reporta resultados falsos positivos para los niveles de NDMA en productos de metformina debido a la coelución de DMF cuando el espectrómetro de masas utilizado no tiene suficiente precisión y resolución.⁷

Conclusión

Se desarrolló un método rápido, altamente selectivo y sensible utilizando la columna Acclaim Polar Advantage II, el sistema Vanquish Horizon UHPLC, el espectrómetro de masas Orbitrap Exploris 120 y el software Chromeleon CDS para la detección y cuantificación de nueve nitrosaminas en productos farmacéuticos de ranitidina disponibles comercialmente. Al combinar cromatografía robusta y reproducible con resolución de masa de 120.000, velocidad de escaneo rápida y precisión de masa por debajo de ppm del sistema Orbitrap Exploris 120, el método proporciona una cuantificación confiable y segura de nueve impurezas de nitrosamina para cumplir con los límites de aceptación regulatoria de la FDA (normas de septiembre de 2020).

Autores: Hao Yang, Thermo Fisher Scientific, San José, CA, EE. UU.; Jon Bardsley, Thermo Fisher Scientific, Hemel Hempstead, Reino Unido; Min Du, Thermo Fisher Scientific, Boston, MA, EE. UU.; Olaf Scheibner, Thermo Fisher Scientific, Dreieich, Alemania.

Referencias:

1. ICH M7(R1). Evaluación y control de impurezas reactivas al ADN en productos farmacéuticos. 2017. ich.org
2. EMA/369136/2020. Impurezas de nitrosamina en medicamentos de uso humano. ema.europa.eu
3. FDA FY19-177-DPA-S. Método LC-HRMS para determinación de NDMA en ranitidina. fda.gov
4. FDA FY19-107-DPA-S. Método LC-HRMS para detección de seis impurezas nitroso en ARB. fda.gov
5. FDA. Método LC-ESI-HRMS para nitrosaminas. fda.gov
6. FDA-2020-D-1530. Control de impurezas de nitrosamina en medicamentos humanos, Guía para la industria. fda.gov
7. Yang et al. Una advertencia: procedimientos analíticos cuantitativos de LC-HRMS para el análisis de NDMA en metformina. The AAPS Journal, 2020, 22:89.

Descubra más: thermofisher.com/nitrosamines

Mayor información:

info@sol-analiticas.com
www.sol-analiticas.com

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