Transferencia de métodos HPLC/UHPLC: guía de parámetros

Escenarios de transferencia de métodos en cromatografía líquida

La transferencia de procedimientos analíticos en cromatografía líquida (LC) es una tarea habitual en muchos laboratorios. Este desafío se puede clasificar en los siguientes escenarios comunes:

1. Aceleración de métodos, por ejemplo de HPLC a UHPLC.
2. Transferencia del método a equipos idénticos, por ejemplo en otro laboratorio.
3. Transferencia del método a un instrumento no idéntico, por ejemplo, a un sistema adquirido recientemente.

Después de la comercialización de instrumentos UHPLC y el uso simultáneo de columnas con partículas menores de 2 µm, el escenario A se convirtió en una tarea común. Existen publicaciones que explican los principios del escalamiento de métodos; por ello, el escenario A no se detalla aquí.

Para los escenarios B y C, el objetivo es obtener resultados equivalentes entre ambos sistemas para disponer rápidamente de un método operativo y reducir los esfuerzos de revalidación. Para el escenario B, el foco es la robustez del método entre dos sistemas idénticos. Los criterios de solidez/revalidación no están dentro del alcance de esta publicación.

El escenario C se enfrenta al transferir métodos validados entre diferentes laboratorios, por ejemplo de desarrollo a control de calidad, o de un laboratorio patrocinador a uno contratado. En este caso es necesario considerar la influencia de los parámetros del instrumento en la separación cromatográfica.

Esta revisión explica los parámetros instrumentales que deben considerarse al transferir un método LC de un sistema a otro, brinda recomendaciones para modificar ciertos parámetros con el fin de obtener resultados equivalentes, y analiza esas modificaciones con respecto al Capítulo General de la USP <621> Cromatografía. No se tratan aspectos como el cumplimiento de SOP o la preparación de buffers.

Categorización de métodos (U)HPLC

La importancia de los parámetros del instrumento para una transferencia exitosa se hizo evidente en los últimos años, impulsada por la creciente participación de laboratorios externos y la tendencia a transferir métodos globalmente dentro de una misma empresa. En ambos casos, los instrumentos frecuentemente no son idénticos y surgen dificultades para reproducir los resultados del laboratorio de origen.

El grado en que un parámetro influye en la tasa de éxito depende en gran medida de la aplicación. Dos parámetros importantes son las dimensiones de la columna (diámetro interior y tamaño de partícula) y el modo de elución. La Figura 1 ilustra la importancia de las principales características del instrumento diferenciando escenarios UHPLC (columna de 2,1 mm d.i., partículas < 2 µm) frente a HPLC (columna de 4,6 mm d.i., partículas ≥ 3 µm) y elución isocrática versus en gradiente.

A partir de estas consideraciones, resulta evidente que el volumen de retardo del gradiente (GDV) es un parámetro crítico para la transferencia de métodos en gradiente. Como los caudales son generalmente más bajos en separaciones UHPLC, pequeñas diferencias en el GDV pueden afectar significativamente los tiempos de retención.

Además, es necesario considerar el modo de termostatización, que describe cómo el instrumento gestiona el calentamiento por fricción dentro de la columna. Durante separaciones HPLC estándar (por debajo de 400 bar / 6 000 psi), el calentamiento por fricción es insignificante. En condiciones UHPLC (hasta 1 500 bar / 22 000 psi), el calentamiento por fricción es significativo y hacer coincidir los modos de termostatización es crucial.

Volumen de retardo de gradiente: qué es y cómo medirlo

El GDV es una característica física de un sistema HPLC que describe la capacidad de retención de todos los componentes interconectados desde el punto de mezcla hasta la entrada de la columna. Sus contribuyentes incluyen la bomba, el muestreador automático y los capilares de conexión. Una consecuencia del GDV es que un gradiente programado puede entrar en la columna con un retraso, calculable con la fórmula:

Como diferentes instrumentos pueden tener diferentes GDV, una composición de disolvente particular puede llegar en distintos momentos a la cabeza de la columna. Controlar el GDV puede reducir considerablemente el tiempo requerido para la transferencia de un método.

Una forma común de medir el GDV es programar un gradiente lineal de 0 % a 100 % B, con el canal B conteniendo un compuesto absorbente de UV. En este caso se utilizó cafeína a 12 mg/L (Figura 2).

El GDV se calcula normalmente usando el momento en que la traza UV alcanza el 50% del valor máximo (flecha verde en la Figura 2), según la fórmula:

donde t₅₀% es el momento en que la traza UV alcanza el 50% del valor máximo, tG es el tiempo total de gradiente y F es el caudal del método.

Un enfoque alternativo usa la diferencia de tiempo entre el inicio del gradiente y el cruce de una extrapolación lineal de la traza UV con la línea de base (flecha azul en la Figura 2). El método del 50% de altura UV (flecha verde) es más confiable y se recomienda. En cualquier caso, no deben compararse valores provenientes de diferentes métodos de evaluación.

El GDV no es una constante fija: depende del caudal y la presión aplicada. La Figura 3A muestra el GDV de un sistema sin amortiguador de pulso con volumen de carrera de pistón constante a diferentes caudales: las diferencias entre GDV mínimo y máximo fueron de hasta el 20%. La Figura 3C muestra el mismo experimento con un sistema con amortiguador de impulsos y volumen de carrera variable, donde el GDV es más de un 40% mayor con el caudal máximo respecto al mínimo. La Figura 3B muestra que el GDV aumenta con la contrapresión en más del 40% cuando se usa amortiguador de impulsos. Dado que la presión puede cambiar drásticamente durante la elución en gradiente, los tiempos de retención se ven afectados por GDV que cambian dinámicamente; esto debe considerarse para una transferencia exitosa.

La Tabla 1 ofrece una descripción general de sistemas HPLC con bomba de gradiente de baja presión, usando 1 ml/min para todas las mediciones. Cabe señalar que el GDV de bombas de gradiente de alta presión es generalmente menor que el de baja presión, lo que hace más desafiante la transferencia entre estos tipos.

Bombas mezcladoras de baja presión versus alta presión

Para formar un gradiente en LC existen dos tecnologías: gradiente de baja presión (LPG) y gradiente de alta presión (HPG). En LPG, la convergencia de disolventes (hasta 4) ocurre antes del cabezal de la bomba mediante una válvula dosificadora de solenoide. Las bombas LPG tienen generalmente un GDV más alto que las HPG.

La diferencia en el concepto de generación de gradiente tiene consecuencias en la precisión del flujo y del gradiente (Figura 5). En un HPG, ambas bombas independientes entregan un flujo parcial según la composición deseada. Por ejemplo, con 50% de metanol, cada bomba entrega 500 µL/min; sin embargo, tras converger en el lado de alta presión, el caudal resultante en la columna será inferior a 1 ml/min por la contracción de volumen de los disolventes. Para un gradiente de metanol, el error es de aproximadamente un 4% con composición de 55-60% de metanol (Figura 5B), pero el gradiente entregado por HPG es exactamente tan lineal como el programado (Figura 5A).

La bomba LPG hace converger los disolventes antes del cabezal, por lo que el caudal en la columna es de 1 ml/min (Figura 5C). Sin embargo, la contracción de volumen durante la convergencia implica que el gradiente entregado no es lineal sino curvado.

Como consecuencia, se recomienda transferir métodos preferentemente entre el mismo tipo de bomba (LPG o HPG) para evitar las consecuencias físicas de las diferencias de diseño.

Ajustes del volumen de retardo de gradiente

Existen dos enfoques generales para adaptar los GDV al transferir un método. Además, el uso de una retención isocrática al inicio de un programa de gradiente es práctica común; cuando el método se transfiere a un sistema con mayor GDV, esa retención puede acortarse, lo cual está permitido según USP <621>.

Adoptando el GDV del sistema receptor

Una forma eficaz de compensar diferencias de GDV es modificar físicamente el GDV del sistema receptor para que coincida con el original. Esto puede lograrse adaptando el volumen del mezclador o el volumen del bucle de muestra. Estos cambios físicos son aceptados y consistentes con las pautas de la USP.

La Figura 6 ilustra la compensación de diferencias de GDV para transferir un método desde un sistema Agilent® 1260 Infinity® II a un Thermo Scientific™ UltiMate™ 3000 SD. Aumentar el volumen del mezclador de 400 µL a 800 µL en el UltiMate 3000 SD produjo una buena coincidencia del perfil de gradiente.

Con esa configuración se transfirió la separación de 10 pesticidas (Figura 7B) y la de medicamentos para enfermedades cardíacas desde un Agilent 1100 (Figura 7A), logrando separaciones casi idénticas en ambos casos.

Adicionalmente, la línea Thermo Scientific™ Vanquish™ UHPLC permite el ajuste fino del GDV mediante un dispositivo en el muestreador automático controlable por software, que varía el GDV predeterminado de cualquier sistema Vanquish hasta un máximo de 100 µL. Esta función es especialmente útil cuando pequeñas diferencias de GDV impiden la transferencia (por ejemplo, separaciones a caudales de 400 µL/min o menos, o transferencias entre bombas binarias de bajo GDV de diferentes proveedores).

Cambiar el punto de inyección en relación con el inicio del gradiente

La segunda posibilidad consiste en mover el momento de inyección en relación con el inicio del gradiente. Por ejemplo, si el sistema de origen tiene un GDV de 0,8 ml y el receptor de 1,8 ml (diferencia de 1 ml), la muestra puede inyectarse después del inicio del gradiente. A un caudal de 1 ml/min, la inyección ocurriría un minuto después del inicio del programa, lo que equivale a comenzar el gradiente en t = −1 min respecto a la inyección. De esta forma, la pendiente y duración del gradiente no se ven afectadas.

La Figura 8 muestra la transferencia de un método para paracetamol y cinco impurezas de un Agilent 1260 a un UltiMate 3000 SD. Dado que esta aplicación opera a solo 120 bar, el mezclador de 800 µL compensó en exceso la diferencia de GDV (cromatograma central). El software Chromeleon™ CDS programó un pre-inicio del gradiente, resultando en una superposición perfecta de ambos cromatogramas (cromatograma inferior), con anchos de pico menores en el sistema UltiMate 3000 SD.

Precalentamiento de fase móvil delante de la columna

La temperatura del disolvente que ingresa a una columna puede afectar tanto las formas de los picos como los factores de retención. Cuando la temperatura del disolvente entrante es significativamente menor que la temperatura de la columna, se forma un gradiente de temperatura radial en la entrada de la columna, denominado efecto de desajuste térmico, que puede provocar ensanchamiento o distorsión de picos. Por ello se recomienda utilizar la capacidad de precalentamiento de eluyentes del sistema HPLC.

Para una transferencia exitosa, deben transferirse también las capacidades de precalentamiento del sistema de origen con la mayor precisión posible, considerando el diseño específico, el principio de funcionamiento y el volumen del precalentador.

Precalentadores activos y pasivos

Los precalentadores pasivos (o preacondicionadores de temperatura) funcionan como dispositivos de intercambio de calor en contacto mecánico con una superficie de temperatura controlada en el compartimento de la columna. Si la temperatura del compartimento es menor que la del eluyente, el dispositivo actúa como preenfriador.

Los precalentadores activos son dispositivos mayormente independientes del control de temperatura del compartimento de la columna, con un elemento calefactor interno que regula activamente la temperatura del eluyente. El precalentador activo de la plataforma Vanquish permite medir y controlar la temperatura del eluyente que fluye hacia la columna, independientemente de la temperatura del compartimento, e incluso establecerla en un valor diferente dentro de ciertos límites. Los precalentadores activos solo pueden calentar (no enfriar por debajo de la temperatura ambiente), ya que utilizan un calentador de resistencia. La Tabla 2 resume las características que distinguen ambos tipos.

En escenarios de transferencia, los precalentadores activos ofrecen ventajas claras por su control de temperatura flexible e independiente: pueden imitar desviaciones esperadas de los dispositivos pasivos o compensar diferencias en la disipación del calor por fricción de la columna.

Selección del precalentador pasivo adecuado

Cuando se usa un precalentador pasivo, el volumen es la principal información disponible. En general, un precalentador de mayor volumen es más eficiente pero aumenta el volumen adicional de la columna (Figura 9) y la dispersión, lo cual puede ser crítico en columnas UHPLC con volúmenes máximos muy bajos.

Los efectos del precalentamiento se investigaron con un termostato de columna de aire forzado UltiMate 3000 usando precalentadores pasivos de 2 µL, 7 µL y 11 µL, pasando agua a temperatura ambiente a través de una columna bajo temperaturas de compartimento de 50 °C, 85 °C y 105 °C, con caudales de 0,25 a 5 ml/min. La temperatura de salida se registró con un sensor PT-1000.

A caudales bajos, la temperatura del eluyente saliente puede superar el punto de ajuste del compartimento (la placa donde se monta el precalentador puede estar más caliente que el aire circundante). A caudales altos, el efecto de calentamiento aumenta con el volumen del precalentador por el mayor tiempo de permanencia del disolvente. Los precalentadores de menor volumen tienen mayor relación superficie-volumen, lo que mejora el calentamiento a caudales bajos. La Tabla 3 muestra los parámetros de los precalentadores utilizados, incluyendo diámetro interno, volumen total y dispersión resultante.

Los efectos combinados de dispersión y efectividad de calentamiento se observan en las Figuras 11 y 12. Sin precalentador, la columna de 2,1 mm (1 ml/min) muestra picos ensanchados (Figura 11), mientras que el desajuste térmico en la columna de 4,6 mm produce división grave del pico (Figura 12). Con precalentador, los picos se vuelven más nítidos y el factor de retención se reduce, con efectos más pronunciados en la columna de diámetro mayor.

Los gráficos N vs k (número de platos vs factor de retención, Figura 13) permiten caracterizar si el grado de dispersión extracolumna de un sistema es adecuado para la columna y el método. Para columnas UHPLC (Figura 13A), operar sin precalentador muestra menor eficiencia con mayor retención (desajuste térmico claro). El precalentador de 1 µL muestra comportamiento normal, con el segundo pico en k = 3,3 alcanzando el 85% del número máximo de platos (aceptable). El precalentador de 11 µL comienza con eficiencia muy baja: el segundo pico en k = 2,7 solo alcanza el 37% de la eficiencia máxima, muy por debajo de las 8 000 placas requeridas. Para la columna de 4,6 mm (Figura 13B), el precalentador de 11 µL muestra el comportamiento más adecuado, mientras que el de 1 µL indica un efecto de desajuste térmico residual.

La conclusión para la selección del precalentador pasivo no es directa. Como regla general: siempre debe usarse un precalentador cuando la temperatura de la columna sea 10 °C o más por encima de la temperatura ambiente; comenzar siempre con el precalentador más pequeño disponible; si el efecto de calentamiento no es suficiente (mala eficiencia en picos de alta retención), probar el siguiente tamaño.

Termostato de columna y ventajas de los precalentadores activos

Los efectos de la termostatización de la columna normalmente no se consideran en el análisis de causa raíz de cromatogramas desviados durante una transferencia de método. Sin embargo, los diferentes modos de termostato de columna aplicados en los instrumentos HPLC pueden tener un efecto significativo en el cromatograma, especialmente por encima de 400 bar (6 000 psi).

En el modo de aire forzado, se elimina más calor por fricción, lo que provoca un gradiente de temperatura radial. En el modo de aire quieto, el calor de fricción no se elimina, lo que genera una temperatura de separación general más alta y reduce la retención, con efectos específicos de cada sustancia sobre la selectividad.

Este efecto se ilustra con la separación de conservantes donde el par de picos críticos (dimetilftalato/metilparabeno) reacciona fuertemente a cambios de temperatura. La Figura 15 muestra la transferencia de un método isocrático desde un sistema UltiMate 3000 BioRS (termostato de aire forzado + precalentamiento pasivo) a un Vanquish Flex en modo de aire forzado o quieto con precalentador activo. En modo de aire forzado, el Vanquish Flex permite una transferencia con resolución aceptable del par crítico. En modo de aire quieto, la temperatura global más alta de la columna reduce la selectividad entre dimetilftalato y etilparabeno, impidiendo una separación suficiente.

Para influir en la temperatura efectiva de la columna, se aprovechó el precalentador activo controlable independientemente. Partiendo de 40 °C en el compartimento y el precalentador, se redujo gradualmente la temperatura del precalentador activo de 40 °C a 30 °C en pasos de 1 °C. Los factores de retención resultantes se correlacionaron con la temperatura del precalentador (Figura 16).

Mediante esta correlación se determinó que una temperatura del precalentador activo de 30,5 °C hace coincidir los factores de retención del dimetilftalato entre ambos sistemas. Para metilparabeno y metilbenzoato los valores son 34 °C y 32 °C, respectivamente. Un valor de 32 °C como promedio permite igualar los tres factores de retención lo más cerca posible.

La Figura 17 muestra que reducir la temperatura del precalentador activo no solo afecta los factores de retención sino que también puede aumentar la eficiencia (en este caso un 10%). La resolución del par crítico se traza en función de la temperatura activa del precalentador (Figura 17B): la intersección indica 36 °C para igualar la resolución entre sistemas; a 32 °C (igualdad de retención), la resolución del Vanquish Flex supera a la del UltiMate 3000 BioRS.

La Figura 18 compara las condiciones del sistema UltiMate 3000 BioRS a 40 °C con las condiciones optimizadas del Vanquish Flex (compartimento en modo aire quieto a 40 °C, precalentador activo a 32 °C). Con esta configuración se igualan los factores de retención, se supera la resolución inicial de 1,58 a 1,93 y se aumenta la eficiencia un 11,5%.

La Tabla 4 proporciona una descripción general de los modos de termostato de columna de los sistemas (U)HPLC de uso común.

Efecto del volumen extracolumna

El volumen extracolumna (ECV) es el volumen desde el inyector hasta el detector, excluyendo el volumen de la columna. Se divide en volumen precolumna (asiento de aguja y tubos de conexión) y volumen postcolumna (tubos de conexión al detector, capilares internos y celda de flujo).

El impacto del ECV depende en gran medida del método. En general, su influencia aumenta al disminuir el volumen de la columna. Añadir 15 µL de ECV adicional a un sistema con columna de 4,6 × 150 mm produce una pérdida de resolución del 1% para un compuesto de baja retención (k = 1) y ninguna para uno más retenido (k = 5). Para una columna de 2,1 × 150 mm, la pérdida es del 19% y el 3%, respectivamente. Por ello, el ECV no puede ignorarse en condiciones UHPLC (columnas de 2,1 mm d.i.).

La Figura 19B muestra un ejemplo en que, debido al ECV extendido, una impureza del pico principal no fue resuelta; usando capilares Thermo Scientific™ Viper™ Fingertight con ECV minimizado, la impureza era distinguible del compuesto principal.

Un ECV significativamente más bajo en el sistema receptor que en el de origen puede ser perjudicial para sustancias que eluyen tempranamente cuando se usan disolventes de muestra fuertes. La Figura 20A muestra los recuentos de platos de tres sistemas distintos frente al volumen de inyección (muestra en metanol 100%, elución agua/acetonitrilo 50:50): el Vanquish Flex exhibe la mayor eficiencia para volúmenes de inyección de 0,5 µL y 1 µL, sin diferencia a 3 µL o más. En tales casos, puede ser útil aumentar artificialmente el volumen precolumna, reducir el volumen de inyección o hacer coincidir el disolvente de la muestra con el eluyente.

La Figura 21 ilustra el enfoque de reducir el volumen de inyección para obtener una forma de pico satisfactoria. El volumen de inyección puede ajustarse según USP <621> si se cumplen los límites de precisión y detección requeridos.

Para separaciones en gradiente, la influencia del ECV es menor por el efecto de reenfoque del pico en la cabecera de la columna. El volumen postcolumna es más relevante que el precolumna en modo gradiente. Conexiones fluídicas deficientes y celdas de flujo de dimensiones inapropiadas pueden resultar en diferente resolución entre sistema de origen y receptor.

Detector: celdas de flujo y configuración del detector

Es fundamental considerar la celda de flujo del detector al transferir métodos. Como regla general, el volumen de la celda de flujo no debe ser mayor al 10% del volumen del pico más pequeño. Si esta relación disminuye, la consecuencia es dispersión del pico, con pérdida de eficiencia y de relación señal-ruido.

Las separaciones de la Figura 22 se realizaron en columnas de 1,0 × 100 mm, 2,1 × 100 mm y 3,0 × 100 mm, usando un monitor UV de baja dispersión seguido de una celda de flujo de alta sensibilidad de 13 µL y trayecto de luz de 60 mm. Para la columna de 3,0 × 100 mm (volúmenes de pico de 27 a 129 µL), la pérdida de resolución entre la celda de 45 nL y la de 13 µL es marginal; para el último pico de elución, la relación volumen de pico / volumen de celda es exactamente 10. Para columnas de menor diámetro, la celda de 60 mm de alta sensibilidad no es adecuada.

Además de las dimensiones físicas de la celda de flujo, la configuración del detector es importante. Para una transferencia exitosa, deben considerarse el ancho de banda, la longitud de onda de referencia y el tiempo de respuesta.

El tiempo de respuesta es una medida de la rapidez con que el detector responde a un cambio de señal. Un tiempo de respuesta mayor reduce el ruido pero puede disminuir la altura de la señal, ampliar el ancho del pico y desplazar los tiempos de retención. La Figura 23 muestra, en una separación SEC de un estándar comercial, una disminución de casi el 13% en el número de platos teóricos al aumentar el tiempo de respuesta; el software Chromeleon CDS calcula tiempos de respuesta óptimos según el ancho de pico obtenido.

El ancho de banda del detector de matriz de diodos (DAD) es el rango de longitud de onda usado para registrar el cromatograma. La Figura 24 muestra el efecto de seis configuraciones de ancho de banda sobre la cuantificación relativa en un método basado en USP para paracetamol y sus impurezas. La relación de área del pico de la impureza B (espectro similar al API) no se ve afectada (Figura 24, línea azul). Por el contrario, la cuantificación relativa de la impureza C y el 4-aminofenol (espectros diferentes al API) sí se ve afectada: para el aminofenol la respuesta relativa disminuye con mayor ancho de banda; para la impureza C aumenta (Figura 24, líneas verde y violeta). Se recomienda considerar con precisión la configuración del detector durante la transferencia, especialmente al trabajar con instrumentos de diferentes proveedores.

Conclusiones: análisis de causa raíz en transferencia de métodos

La transferencia de métodos HPLC depende de múltiples factores. Los tiempos de retención que no coinciden pueden deberse a:

• Diferentes principios de bombeo (LPG vs HPG)
• Diferentes GDV
• Diferentes principios de termostatización de columna
• Uso diferente del precalentador

Una pérdida de resolución puede deberse a:

• Desajuste térmico por precalentamiento o termostatización de la columna
• Efectos de dispersión extracolumna adicionales
• Disolventes de muestra no coincidentes
• Configuración del detector

Los siguientes esquemas de flujo proporcionan orientación para el análisis de causa raíz de desviaciones observadas durante la transferencia de métodos.

Autores

Carsten Paul, Maria Grübner, Michael Heidorn, Matthias Krajewski, Sabrina Patzelt, Thomas Piecha y Frank Steiner. Thermo Fisher Scientific, Germering, Alemania.

Referencias

1. Guillarme, D. et al. Transferencia de métodos para cromatografía líquida rápida en análisis farmacéutico: Parte I, separación isocrática. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 2007, 67(3), 475–482.
2. Guillarme, D. et al. Transferencia de métodos para cromatografía líquida rápida en análisis farmacéutico: Parte II, gradiente. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 2008, 68(2), 430–440.
3. Franz, H. et al. Thermo Fisher Scientific TN 75: Una herramienta universal para la transferencia de métodos de HPLC a UHPLC, 2013.
4. USP Capítulo General <621> Cromatografía. United States Pharmacopeia and National Formulary, usp.org.
5. Hong, P. et al. Waters Corporation Technical Report: Volumen de permanencia y volumen extracolumna, 2016.
6. Conductividad térmica de líquidos. Engineering and Design of Heat Transfer, engineersedge.com.
7. Dolan, J. Diámetro de columna, velocidad lineal y eficiencia de columna. LCGC North America, 2010, 28(2), 114–120.
8. Manka, A. et al. Thermo Fisher Scientific TN 165: Rendimiento de detección de trazas con el detector DAD Vanquish y la celda de flujo LightPipe de alta sensibilidad, 2016.

Más información:
www.sol-analiticas.com
info@sol-analiticas.com

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